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分子診斷三大經典技術：qPCR、NGS、數字PCR！

日期:2022-05-17

分子診斷是將分子生物學技術應用于疾病診斷的醫學分支學科，利用分子生物學技術研究人體內源性或外源性生物分子的存在、結構或表達調控變化，為疾病的預防、預測、診斷、治療、預后和轉歸提供信息和決策依據。精準醫療的發展，將持續推動分子診斷的進步。目前常見核酸分子診斷技術涉及三個技術：熒光定量PCR技術（qPCR）、高通量測序技術（NGS）和數字PCR。如何選擇，我們作一下簡要介紹。

qPCR

在1983年，美國人Mullis發明了聚合酶鏈反應技術(polymerase chain reaction, PCR),這一技術將DNA的變性原理以及復性原理加以利用，采用適溫延伸、高溫變性以及低溫復性，讓核酸片段實現了體外擴增，可將極微量的目標DNA特異地擴增上百萬倍，從而提高對DNA分子的分析和檢測，因為PCR有著很高的靈敏度以及特異性，而且簡便快速，所以這種技術已經成為目前臨床基因擴增實驗室接受程度最高的技術。

qPCR通過熒光染料或熒光特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時監控反應過程。每擴增一條DNA鏈，就有熒光染料分子結合到雙鏈DNA上或有熒光分子從探針上釋放，實現熒光信號的累積。由于熒光積累與PCR產物形成完全同步，可通過軟件對熒光積累信息進行分析和計算，獲得待測樣品模板的初始濃度。但是，qPCR只能夠通過標準曲線和標準品進行相對定量，無法做到精準絕對定量。

NGS

基因測序是直接獲得核酸序列信息的唯一技術手段,是分子診斷技術的一項重要分支。雖然分子雜交、分子構象變異或定量PCR技術在近幾年已得到了長足的發展,但其對于核酸的鑒定都僅僅停留在間接推斷的假設上,因此對基于特定基因序列檢測的分子診斷,核酸測序仍是技術上的金標準。

NGS可以一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。在基因組水平上，NGS可進行從頭測序而獲得該物種的全長序列，為后續研究奠定基礎；對已知參考序列的物種，進行全基因組重測序可檢測新的突變位點，發現個體差異的分子基礎。在轉錄組水平上，NGS可進行全轉錄組測序，開展可變剪接、基因表達差異、新非編碼RNA分子發現等研究。

NGS與染色質免疫共沉淀和甲基化DNA免疫共沉淀技術相結合，可檢測出與特定轉錄因子結合的DNA區域和基因組上的甲基化位點。NGS功能強大，適合用于探索篩選新的生物標志物，但是實驗操作較復雜，數據分析難度較大，檢測周期長，成本較高。

數字PCR

數字PCR是新興起來的一種核酸分子絕對定量技術。該技術可直接獲得DNA分子的拷貝數，實現起始樣品中核酸分子的絕對定量，且無需標準品或內標。數字PCR已經被廣泛應用到醫學、生物學等各個領域，如拷貝數變異、突變檢測、復雜來源樣品中低豐度核酸分子檢測、NGS數據驗證、miRNA等微小差異表達研究、單細胞基因表達分析等方面，在已知突變的癌癥分子標志物的檢測、傳染病病原體檢測、基因組三倍體分析和基因表達分析等領域展現了強大的優勢。

總結

在實驗過程中，大家會有疑問：選擇哪種檢測技術才能更好的達到預期結果？通過突變檢測限、定量能力、操作簡易程度、檢測費用、適用場所、發現未知序列等方面進行比較，您或許會有自己的答案。

從上表來看，數字PCR因為靈敏度高、絕對定量、適合于醫院操作等優點，在腫瘤液體活檢、無創產前篩查、感染性疾病早期診斷等臨床檢測應用方面具有顯著優勢。NGS在檢測未知序列、未知突變、高通量多位點檢測方面是更好的選擇，是科研和獨立實驗室服務的好工具。qPCR適用于較常規的臨床分子診斷項目。

總的來看，分子診斷技術的應用不僅深化對疾病發病機制分子生物學的基礎研究，而且不斷擴大了分子診斷疾病的病種，隨著人類基因組計劃的完成和蛋白質組計劃的啟動，分子診斷方法將極大地推動現代檢驗醫學的迅速發展，并通過這些基本技術的衍生、聯合產生新的分析方法，從而提高分子診斷的特異性、敏感性和準確性，為臨床醫學診斷和治療提供更準確的數據和信息。

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