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附件1?

北京市醫療器械病毒滅活工藝驗證檢查指南

（征求意見稿）?

同種異體植入性醫療器械和動物源性醫療器械作為高風險醫療器械，其質量至關重要。其與普通的無菌醫療器械的主要區別在于病毒是否已被完全滅活，未滅活的產品應用到人體則會增加病毒傳播和免疫原性等方面的安全風險，且存在材料表征上的困難，因此醫療器械病毒滅活工藝控制顯得尤為重要。《醫療器械生產質量管理規范》及其配套附錄、現場檢查指導原則中均對醫療器械病毒滅活提出了明確的要求。

本檢查指南歸納了醫療器械生產過程中特定病毒滅活工藝的效果進行驗證的一般要求，旨在幫助北京市醫療器械監管人員增強對病毒滅活知識的了解和學習，提高全市醫療器械監管人員對醫療器械病毒滅活過程的監督檢查水平。同時，為醫療器械生產企業加強對醫療器械病毒滅活的管理提供參考。醫療器械生產企業應當依據具體產品的特性明確所采用的病毒滅活工藝及相關參數等要求的適宜性，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。

當國家相關法規、標準、監管要求等發生變化時，應當重新修訂以確保本檢查指南持續符合要求。

一、適用范圍

本檢查指南可作為北京市藥品監督管理局組織、實施醫療器械注冊質量管理體系現場核查、《醫療器械生產許可證》現場核查、醫療器械生產監督檢查等涉及醫療器械病毒滅活過程檢查的參考資料。

二、檢查要點

（一）原則要求

我國目前對同種異體植入性醫療器械產品組織供體的病毒篩選多采用檢測血清中病毒特異性抗體或抗原的方法，其中對人免疫缺陷病毒（HIV）還要求檢測血液中的病毒核酸。但是，盡管對供體進行了嚴格的篩選，仍然存在漏檢和未知病毒存在的風險，以及生產過程中帶入外源病毒的風險。因此，要求同種異體植入性醫療器械產品在生產過程中采用有效的病毒滅活工藝，并對病毒滅活工藝的有效性進行科學的驗證。

動物源性醫療器械對于感染病毒和傳染性因子的風險控制也需至少從源頭控制和工藝過程控制兩方面著手，企業應按照醫療器械生產質量管理規范的相關要求在生產質量體系中建立一套專門針對動物源性風險因素的控制和追溯體系。在動物源性材料或醫療器械的生產工藝中需考慮設置病毒滅活的相關步驟，企業應對病毒滅活工藝的有效性進行科學的驗證。

滅活和去除病毒和/或傳染性因子的處理步驟有可能是以犧牲材料本身的使用性能或增加新的風險為代價的，生產企業需充分評估其對產品的不利影響，以保證產品最終能夠安全有效地使用。

（二）現場檢查關注點

4.需關注產品原材料、結構組成、生產工藝、生產場地變更等情況，是否對可能影響病毒滅活的效果進行了評估，確認是否需對病毒滅活工藝的效果進行再驗證。

（三）同種異體植入性醫療器械病毒滅活控制要求

1.同種異體植入性醫療器械常用的病毒滅活方法

同種異體植入性醫療器械的病毒滅活有多種方法，企業應根據產品的特性選擇合適的病毒滅活工藝。采用病毒滅活工藝應綜合考慮病毒滅活效果的驗證，病毒滅活工藝對產品性能的影響，病毒滅活工藝本身的公認性、可靠性、重現性、易放大性及經濟性。常用的病毒滅活方法舉例如下。

（1）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）

巴氏消毒法是濕熱滅活法之一，利用病毒不耐熱的特點，通過適當溫度和保溫時間處理，滅活病毒。該滅活方法可滅活脂包膜和部分非脂包膜病毒。同種異體植入性醫療器械在充分清洗血液及骨髓成分后，可運用該方法進行病毒滅活。采用該方法時應考慮溫度分布的均一性和滅活時間。

（2）γ射線輻照滅活法

γ射線輻照滅活法是主要通過破壞核酸而滅活病毒，其優點包括滅活效率高、穿透力強、劑量易控制、無有害物質殘留、無明顯溫度升高等。由于病毒在不同介質中對射線的抗性不同，該方法用于同種異體植入性醫療器械的病毒滅活時，應去除產品中的宿主組織和細胞，例如同種異體骨應充分清洗血液及骨髓成分。采用該方法時應根據產品的特性確定輻照劑量，考慮輻照劑量的分布和滅活時間。

（3）過氧乙酸-乙醇滅活法

過氧乙酸-乙醇滅活法可滅活脊髓灰質炎病毒、艾滋病病毒、偽狂犬病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、豬細小病毒等多種病毒。其用于同種異體植入性醫療器械病毒滅活的效果已為實驗室和臨床試驗所證實。過氧乙酸具有極強的病毒滅活能力，乙醇可降低溶液的表面張力，有助于消毒劑完全滲透入同種異體植入性醫療器械中。采用該方法時應嚴格控制產品過氧乙酸殘留量及乙醇殘留量，考慮滅活實際濃度和滅活時間。

（4）乙醇滅活法

乙醇是臨床上最為常用的表面消毒劑。該方法對多數有包膜病毒，如單純皰疹病毒、艾滋病病毒等具有滅活作用。在用于同種異體骨的病毒滅活時，應充分清洗血液及骨髓成分。采用該方法時應嚴格控制乙醇殘留量，考慮乙醇濃度和滅活時間。

2.同種異體植入性醫療器械病毒滅活工藝的驗證

（1）指示病毒的選擇

應選擇醫療器械可能污染的病毒，或與該病毒理化性質相似的病毒。病毒選擇應具有代表性，需考慮病毒顆粒的大小、核酸類型以及有無包膜等方面，應考慮選擇對物理和/或化學處理有明顯抗性的病毒。根據產品的特性及所采用的病毒滅活工藝，至少應選擇四類指示病毒，包括有包膜RNA病毒、有包膜DNA病毒、無包膜RNA病毒、無包膜DNA病毒，可參照下表選擇適宜的指示病毒。注冊申請人應結合產品的生產工藝過程，考慮HIV對病毒滅活工藝的滅活抗性，確保相應剩余風險可接受。?

表1 可經同種異體植入性醫療器械傳播疾病的相關病毒及可選用的指示病毒（舉例）

（2）染毒方法

由于同種異體植入性醫療器械多為固體形態，應盡量模擬植入材料的病毒負載方式，考慮材料的結構、尺寸和致密性，以及病毒在材料中的分布情況，結合產品特點選擇合適的染毒方法，可采用浸泡法染毒（若適用）。病毒滅活零時的滴度應至少≥10⁶TCID₅₀/mL，可根據產品和病毒的特點，選擇合適的浸泡溫度、時間及其他條件。

（3）方案設計

3.1試驗分組：應進行合理分組，注意設置全面的對照組，對照組的設計應能夠用于判定病毒滅活效果，以確保結果的科學性。建議包括細胞空白對照組、病毒對照組、樣品細胞毒性對照組（或滴定前進行細胞毒性試驗）、病毒滅活方法終止對照組及試驗組。其中，病毒對照組的滴度是計算滅活量的基礎，應證實其病毒的零時滴度≥10⁶TCID₅₀/mL。病毒滅活方法終止效果對照組需采用稀釋、中和或其他適宜方法終止病毒滅活方法的作用，其病毒滴度應與病毒對照組相當或接近，以證實病毒滅活方法能夠在設定的時間終止作用。試驗組至少應有適宜的時間點（包括零時），以闡明病毒滅活的動力學，包括病毒滅活動力學曲線。

3.2觀察指標：

3.2.1滅活病毒的滴度，采用細胞病變或其他適宜的指標。

3.2.2病毒滅活速率、滅活曲線。以列表和做圖的形式報告驗證結果。

3.3病毒滅活效果的判定

應綜合判斷病毒滅活的有效性，除了考慮病毒滅活的量以外，還必須考慮如下因素，審慎評價每次驗證結果。

3.3.1所選擇的指示病毒是否適宜，驗證的設計是否合理。

3.3.2病毒滴度降低量：病毒滅活零時的滴度為污染了病毒的組織釋放的病毒量，通過與病毒滅活后測定的殘留病毒量比較，計算出該方法實際滅活病毒量。病毒滴度降低量≥4 logs，表示該方法滅活病毒有效。如因檢測方法的靈敏度造成檢測出的病毒降低量接近但小于4 logs時，應盲傳三代，如無病毒檢出，亦可認為是有效的去除/滅活病毒步驟。病毒去除/滅活有效性驗證的目的是為了確定生產工藝去除/滅活病毒的能力，因此需獲得生產全過程中估計去除/滅活病毒的總降低量。一般每種指示病毒的總降低量為各步驟降低數量的總和。但是由于驗證方法的局限性，如分步驟中指示病毒降低量≤1 log，則不宜將其計算在總量中。

3.3.3病毒滅活動力學：病毒滅活通常不是簡單的一級反應，評價驗證結果不能僅考慮病毒降低量，同時也要考慮病毒滅活動力學。需以作圖的形式報告滅活動力學驗證結果。如果指示病毒殘留量很快降到最低檢出限度值，則說明此方法滅活病毒效果較好；如果指示病毒滅活速率緩慢，在滅活結束時才達到最低檢出限度值，則不能認為是一個有效的病毒滅活方法，或者殘留的指示病毒對該滅活方法有抵抗力，說明該步病毒滅活方法無效。

（4）病毒滅活工藝驗證原則

4.1若采用一步病毒滅活工藝，應同時對有包膜RNA病毒、有包膜DNA病毒、無包膜RNA病毒、無包膜DNA病毒等四類病毒或其指示病毒（參見表1）的滅活效果均達到4?logs以上，可認為是有效病毒滅活工藝；若采用多步不同滅活原理的病毒滅活工藝，應分別進行病毒滅活效果驗證，并保證上述每類病毒滅活工藝至少有一步的滅活效果可達到4?logs以上。

4.2若采用的病毒滅活/去除工藝將導致醫療器械產生不可接受的性能改變，則需要根據產品來源、采集及過程控制情況以及對患者的風險/受益分析來判斷其可接受性，但其單一去除/滅活病毒步驟的降低量仍需達到4 logs以上。

5.舉例說明病毒滅活效果的判斷

5.1初始病毒負載量為6?logs ，檢測到剩余病毒量為4?logs，則該病毒滅活工藝不是有效工藝，只能說明具有一定的病毒滅活作用。

5.2初始病毒負載量為6 logs ，但由于產品本身的細胞毒作用使得檢測靈敏度限值為4 logs ，僅能證明滅活2 logs 的病毒。此種情況需改變試驗設計重新進行驗證，或者應盲傳三代，如仍無病毒檢出，可認為是有效的病毒滅活方法。

5.3初始病毒負載量為6 logs ，但仍可檢測到2 logs 的剩余病毒，且清除病毒的量可重復，應認為是有效的滅活病毒的方法。

5.4初始病毒負載量為6 logs ，之后未檢測出病毒。但是由于檢測靈敏度限值為2 logs ，僅能認為大約滅活了4 logs 病毒。事實上可能等于或大于4 logs ，因此應判定此方法為有效的滅活病毒的方法。

6.其他需考慮的問題

6.1如果樣品必須做進一步處理，或不同時間取出的樣品要在同一時間進行測定，應考慮這些處理方法對病毒檢測結果的影響。

6.2模擬的生產工藝參數應盡可能與實際的生產工藝相一致，如pH、溫度、反應時間等。應分析生產工藝中各種參數的偏差對病毒滅活效果的影響。

6.3病毒滅活工藝對某些類型病毒滅活效果的局限性。

（四）動物源性醫療器械病毒滅活控制要求

為了提高動物源性醫療器械的安全性，生產過程中需存在特定的滅活/去除病毒工藝步驟。為確認這些工藝步驟對于滅活/去除病毒的有效性，需進行相應的驗證工作。對這些工藝的滅活/去除病毒有效性的驗證，需至少遵循以下原則：

1.驗證研究的設計

（1）病毒滅活/去除有效性驗證研究通常是將已知量的指示用活病毒，加入到待驗證的工藝步驟處理前的模擬原材料或中間品中，然后定量測定經工藝步驟處理后指示病毒數量下降的幅度，由此評價生產工藝的去除/滅活病毒效果。需合理設計與實際生產工藝相關的病毒去除/滅活研究試驗方案。一般只對可能或預期具有病毒去除/滅活效果的工藝步驟進行驗證，不必對每個生產工藝步驟都進行驗證。

為達到有效地去除/滅活效果，生產工藝中通常會聯合使用滅活與去除步驟，甚至多個從機制上能夠互補的去除和/或滅活步驟。如果產品的生產工藝中包含了采用不同病毒去除/滅活方法（這里指不同機制的方法）的滅活/去除工藝步驟，需對這些步驟分別進行病毒去除/滅活效果驗證。每一滅活/去除工藝步驟的病毒降低系數計算公式如下：

降低系數 R = log₁₀ [（V₁×T₁）/（V₂×T₂）]

其中，V₁為步驟開始前材料的體積，V₂為步驟完成后的材料的體積，T₁為步驟開始前材料中的指示病毒滴度，T₂為步驟完成后材料中的指示病毒滴度。

注意：降低系數計算時要基于樣品中可檢測的指示病毒量，而不是基于所加入的指示病毒量。

（2）為避免將任何病毒人為的引入實際生產設施，驗證工作應在單獨的實驗室中進行，因此通常采用縮小規模的生產工藝來模擬實際生產工藝。采用縮小規模生產工藝的方法，需盡可能模擬真實生產過程，按照能代表去除和/或滅活病毒能力最差情況的條件進行設計。需分析生產工藝中各種參數的偏差對病毒去除/滅活效果的影響。

（3）病毒滅活/去除的有效性同材料的結構、尺寸和形狀以及病毒在材料中的分布有關，在研究設計中宜對此予以考慮。當驗證樣品為固體材料時，需盡量模擬生物材料的病毒負載方式，使負載指示病毒充分而且均勻地浸入到材料的內部。若此法不可行，則需盡可能采用對于去除/滅活效果更為不利的指示病毒負載方式。

（4）要獲得對每個滅活/去除工藝步驟的準確評價，必須保證每個步驟在起始時加入了足夠多的指示病毒負載量。然而，所加入的指示病毒懸液的體積不宜超過試驗樣品總體積的10%，以使試驗樣品在成分方面與生產材料保持相近。

（5）如果可能，含有指示病毒的試驗樣品除所驗證的病毒滅活/去除步驟之外不宜再經過進一步的處理（如超速離心、透析）或儲存而直接進行檢測。在進一步處理或儲存無法避免時，宜采用適當的對照，以確定這些處理和儲存過程對研究結果的影響。需詳細說明樣本制備及驗證試驗的過程并論證其合理性。

（6）所采用的病毒定量檢測分析方法需具有充分的靈敏度和可重復性，需設計適宜的重復樣本試驗和對照，以確保結果具有統計學意義上足夠的精確性（同一檢測方法內樣本組內和組間差異的95%可信限宜達到±0.5log以內，否則需對檢測結果的可信度進行充分的論證）。需考慮研究材料中的某些特殊成分可能會對檢測的準確度造成干擾，盡量設計采取相應措施避免這些干擾。若無法避免，必要時需對干擾進行定量評估。若采用感染性病毒檢測以外的其他方法進行病毒測定，需提供充分的論證依據和理由。

（7）滅活研究宜設計為在不同的時間點（包括零時）采樣，從而建立滅活動力學曲線。

（8）在進行去除研究時，如生產工藝中去除病毒的原理是通過將病毒分離為沉淀物或去除某些組分來降低病毒的感染性，則需對被除去的樣品也進行研究。宜盡可能給出病毒在不同部分間的對比分布。

2.指示病毒的選擇

首先，需要選擇與實際生產用的動物源性材料中可能含有的病毒種類相關的指示病毒，不能用相關病毒的，要選擇與其理化性質盡可能相似的指示病毒；第二，所選擇的指示病毒理化性質需有代表性（病毒大小、核酸類型以及有無包膜），其中至少需包括一種對生產工藝所涉及的物理和/或化學處理有明顯抗性的病毒；第三，指示病毒初始滴度需要盡可能高（一般需≥10⁶/mL）。

表2列舉了已用于病毒滅活/去除研究的指示病毒。病毒的耐受性與特定的處理方式有關，只有在了解病毒生物特性和生產工藝特定情況下才能使用這些病毒，而且實際結果會隨著處理情況的變化而變化。

表2 已用于病毒滅活/去除研究的指示病毒舉例

對于病毒去除/滅活效果的判斷，應考慮同時達到以下兩個要求：3.效果的判定

（1）去除/滅活降低系數的要求

病毒去除/滅活有效性驗證的目的是為了確定生產工藝去除/滅活病毒的能力，因此需獲得生產全過程中估計去除/滅活病毒的總降低系數。一般每種指示病毒的總降低系數為各步驟降低系數的總和。但是由于驗證方法的局限性，如分步驟中指示病毒降低系數≤1 log，則不宜將其計算在總量中。在分析試驗結果時需注意，如果將多步驟的去除/滅活病毒降低系數相加（特別是將去除/滅活效果不明顯的步驟相加）或者將工藝過程中重復采用的同樣或者類似去除/滅活機制形成的去除/滅活效果累加，可能會高估工藝實際能達到的效能。需考慮有效步驟對指示病毒的去除/滅活效果可能與實際生產工藝中使用的效果有一定偏差。

一般來說，醫療器械的生產過程中去除/滅活病毒的總降低系數宜達到6 logs以上（即病毒數量下降到進行去除/滅活前數量的百萬分之一以下），并且原則上需至少有一個病毒去除/滅活步驟的降低系數達到4 logs以上（如因檢測方法的靈敏度造成檢測出的病毒降低系數接近但小于4 logs時，應盲傳三代，如無病毒檢出，亦可認為是有效地去除/滅活病毒步驟）。如果采用總降低系數達6 logs的病毒滅活/去除工藝將導致醫療器械產生不可接受的性能改變，則需要根據動物源性材料的來源、采集及處理過程控制情況以及對患者的風險/受益分析來判斷其可接受性，但其單一去除/滅活病毒步驟的降低系數仍需達到4 logs以上。

即使驗證研究證明了去除/滅活病毒工藝的有效性，這僅說明動物源性材料中殘留病毒的感染性大幅度降低，但其數值永遠不可能降至零。

（2）病毒滅活動力學要求

評價驗證結果不能僅考慮病毒降低量，同時也要考慮病毒滅活動力學。需以作圖的形式報告滅活動力學驗證結果。如果指示病毒殘留量很快降到最低檢出限度值，則說明此方法滅活病毒效果較好；如果指示病毒滅活速率緩慢，在滅活結束時才達到最低檢出限度值，則不能認為是一個有效的病毒滅活方法。

4.關于朊蛋白

由于目前尚難以采用致病性朊蛋白（如傳染性海綿狀腦病因子）的指示因子對去除朊蛋白的工藝進行驗證，因此對牛、羊源性材料制品的傳染性海綿狀腦病安全性還主要是對源頭進行控制。基于目前對朊蛋白去除/滅活工藝驗證的認知程度，對于牛、羊源性醫療器械，可以按照本指南闡述的原則進行的病毒去除/滅活有效性驗證。隨著對朊蛋白研究水平的不斷提高，相應的要求也將隨時調整。

????三、名詞術語

病毒滅活工藝：是指生產企業采用特定的病毒滅活方法對其產品進行病毒滅活。

同種異體植入性醫療器械：是指以人體來源組織為原料加工或組成的產品，例如同種異體骨、肌腱、脫細胞異體真皮等。

動物源性醫療器械：是全部或部分采用無生命動物組織制成的或取材于動物組織的醫療器械產品（體外診斷用醫療器械除外），這些材料是多種多樣的，可以構成該器械的主要部件（例如牛/豬源心臟瓣膜、羊腸縫合線、止血材料等）、涂層或者浸滲劑（例如肝素、明膠、膠原等），也可成為生產過程中所用的輔助材料（例如牛脂等）。?

參考文獻：

1.《關于發布醫療器械生產質量管理規范的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第64號）

2.《關于發布醫療器械生產質量管理規范附錄無菌醫療器械的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2015年第101號）

3.《關于發布醫療器械生產質量管理規范附錄植入性醫療器械的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2015年第102號）

4.《關于印發醫療器械生產質量管理規范現場檢查指導原則等4個指導原則的通知》（食藥監械監〔2015〕218號）

5.《同種異體植入性醫療器械病毒滅活工藝驗證技術審查指導原則（2020年修訂版）》

6.《動物源性醫療器械注冊技術審查指導原則（2017年修訂版）》

7.《血液制品去除／滅活病毒技術方法及驗證指導原則》（國藥監注〔2002〕160號）

8. YY 0771動物源醫療器械系列標準