受理號：CSZ2200011
體外診斷試劑產品注冊技術審評報告
產品中文名稱：α 和 β 地中海貧血基因檢測試劑盒 （聯合探針錨定聚合測序法）?
產品管理類別：第三類?
申請人名 稱：華大生物科技（武漢）有限公司?
國家藥品監督管理局?
醫療器械技術審評中心
基本信息
二、申請人住所 武漢市東湖新技術開發區高新大道 666 號武漢國家生物 產業基地項目 B、C、D 區研發樓 B2 棟?
三、生產地址 武漢市東湖新技術開發區高新大道 666 號武漢國家生物產 業基地項目 B、C、D 區研發樓 B2 棟五樓、B1 棟一樓
技術審評概述
一、產品概述?
表 1 主要組成成分
（二）產品預期用途?
本試劑盒用于文庫構建，采用高通量測序技術（聯合探 針錨定聚合測序法）定性檢測人外周血樣本中基因組 DNA的 4 種 α-地貧缺失型、2 種 β-地貧缺失型、3 種 α-地貧非缺失 型和 16 種 β-地貧非缺失型。用于 α 和/或 β 地貧的輔助診斷（遺傳診斷）。本試劑盒檢測結果不作為地中海貧血臨床診 斷的唯一依據，僅供臨床參考。?
表 2 試劑盒檢測的地中海貧血基因變異信息
（三）產品包裝規格?
（四）產品檢驗原理?
根據 α-地貧和 β-地貧發生相關的 HBA1、HBA2 和 HBB 三個基因的特點設計一系列引物，以實現基因的有效擴增。利用多重 PCR 技術將樣本中的 HBA1、HBA2 和 HBB 基因 擴增富集并同時引入用于樣本識別的標簽序列。將多例（≤96 例）樣本的 PCR 產物按一定比例混合成一個文庫，經過 一系列的文庫制備過程，每個文庫中的樣本 DNA 序列都加 上了用于測序及文庫識別的接頭序列。將制備好的文庫等質 量比例上機測序，使用基因測序儀通過聯合探針錨定聚合測 序技術對各文庫中的樣本 DNA 進行序列信息讀取。每一條 DNA 的測序結果經過文庫接頭序列、樣本標簽序列和引物序 列比對拆分后將被精確定位到每一個樣本的每一個擴增區 域中。
將每個樣本的目標區域的測序結果與以 GRCh37 基因 組序列為參考構建的目標參考序列進行比對分析，再通過變 異檢測、陽性判斷值以及來自于 HbVar（2017 年 10 月版） 和 Ithanet 數據庫（2017 年 10 月版）的變異坐標信息與變異 名稱信息，判斷樣本中是否存在地貧基因變異以及何種變異。
?二、臨床前研究概述?
試劑盒主要原材料包括：PCR 標簽引物、PCR 反應液、 PCR 反應熱啟動酶、測序接頭、末端修復緩沖液、T4 多聚 核苷酸磷酸激酶、T4 DNA 聚合酶 （rTaq 聚合酶）、Klenow Fragment、加“A”酶、連接酶、磁珠、陽性對照品、陰性對照 品等。主要原材料均為外購方式獲得。PCR 標簽引物和測序 接頭為申請人自行設計后由專業的合成公司合成。
申請人選擇有資質的供應商提供原料，通過功能性試驗篩選出最佳原 材料和供應商，制定了各主要原材料質量標準并經檢驗合格。?
企業參考品包括陽性參考品、陰性參考品、重復性參考 品、精密度參考品、檢測限參考品。陽性參考品 37 份，由外 周血樣本和細胞系樣本組成，樣本涵蓋該產品可檢出的所有 變異類型的雜合型；陰性參考品 14 份，由外周血樣本和細胞 系樣本組成，包含無變異樣本、產品檢測范圍外的地貧變異 類型樣本及同源序列變異樣本；重復性參考品 5 份，均為細 胞系樣本，涵蓋產品可檢出的 4 種代表性變異類型和 1 份無 變異的陰性樣本；精密度參考品 5 份，為包含弱陽性濃度水 平在內不同濃度水平和無變異的外周血樣本；檢測限參考品 4 份，均為細胞系樣本，每份檢測限參考品做高、中、低 3 個 水平的梯度稀釋，涵蓋該產品可檢出的 4 種代表性變異類型；檢測限參考品 37 份，由細胞系樣本和外周血樣本組成，包含 產品可檢出的所有變異類型的最低檢出限水平。?
試劑盒包含 4 份陽性對照品和 1 份陰性對照品，用于檢 測過程的質量控制。陰陽性對照品均為細胞系樣本，陽性對 照品涵蓋該產品可檢出的 4 種代表性變異類型，陰性對照品 為無變異樣本。?
申請人通過對多重 PCR 反應引物配比、PCR 反應標簽 引物用量、PCR 反應體系和反應條件、PCR 產物混合比例、 陽性對照檢測方式、文庫制備起始量、純化磁珠用量、打斷 參數、末端修復反應體系、末端修復反應時間、加 A 反應體 系、連接反應體系、篩選磁珠用量、樣本有效序列數、上機 文庫數等條件進行篩選和優化，通過功能性試驗，最終確定 了最佳的生產工藝與反應體系。?
分析性能評估包括核酸提取試劑性能研究、準確度、重 復性、精密度、分析特異性、分析靈敏度等性能評估。針對核酸提取試劑性能研究，申請人采用臨床樣本平行 比較了核酸純化試劑和核酸提取試劑的提取性能，通過對比 提取所得 DNA 的濃度和純度，確定核酸提取試劑為該產品 的配套提取試劑。?
準確度評估中，申請人分別在兩種適配機型（基因測序 儀（MGISEQ-2000）和基因測序儀（MGISEQ-200））上使用 三批試劑盒對企業參考品盤中的 37 份陽性參考品進行檢測， 陽性符合率為 100%。另外，申請人分別在兩種適配機型（基 因測序儀（MGISEQ-2000）和基因測序儀（MGISEQ-200）） 上使用一批試劑盒對已知臨床檢測結果的臨床樣本進行檢 測，試劑盒檢測范圍內各變異類型的陽性符合率、陰性符合率和總符合率均為 100%。精密度評估中，申請人使用三批試劑盒對臨界濃度 10 ng/μL 和中高濃度 15 ng/μL 的 5 份外周血樣本和 1 份細胞系 樣本在兩個實驗室由兩組操作者在不同適配機型（基因測序 儀（MGISEQ-2000）和基因測序儀（MGISEQ-200））的不同 儀器上進行檢測，每個濃度的每個樣本重復檢測 3 次，連續 檢測 20 天。檢測結果均與已知結果一致。分析特異性評估中，申請人分別在兩種適配機型（基因 測序儀（MGISEQ-2000）和基因測序儀（MGISEQ-200））上使用三批試劑盒對企業參考品盤中的 14 份陰性參考品進行 檢測，陰性符合率為 100%；對 Hb Q-Thailand、Hb New York、 Hb J-Bangkok 等具有同源性序列的血紅蛋白異常樣本和-- FIL、-α21.9、Hb Lepore-Boston-Washington 等檢測范圍外的 地貧變異陽性樣本進行檢測，檢測結果均為未檢出檢測范圍 內的基因變異；對梯度稀釋的血紅素、甘油三酯、膽紅素、 肝素鈉、EDTA?K2、甲磺酸去鐵胺、地拉羅司分散片、葉酸 片和愛樂維（復合維生素片）、布洛芬、鹽酸氨溴索、蒲地藍 消炎膠囊、頭孢克肟干擾樣本進行檢測，檢測結果表明，當 DNA 樣本中血紅素濃度≤200g/L、甘油三酯濃度≤1000 mg/dL、膽紅素濃度≤2 mg/dL、EDTA?K2 濃度≤2.5 mg/mL、 甲磺酸去鐵胺濃度≤1.6 mg/mL、地拉羅司濃度≤1.6 mg/mL、葉酸濃度≤0.38 mg/L、愛樂維(復合維生素)平均濃度 ≤35.6 mg/L、布洛芬濃度≤0.143mg/mL、鹽酸氨溴索濃度≤ 0.12mg/mL、頭孢克肟濃度≤0.286mg/mL、蒲地藍消炎膠囊 濃度≤2.86mg/mL 時，干擾物質對試劑盒檢測結果無明顯影響，試劑盒具有較好的抗干擾能力。當樣本中的肝素鈉濃度 在 2IU/mL 以上時，試劑盒檢測失敗率高，試劑盒不適用于 檢測肝素鈉抗凝采血管采集的樣本，樣本采集應選用 EDTA?K2 抗凝采血管。最低檢測限研究中，申請人分別在兩種適配機型（基因 測序儀（MGISEQ-2000）和基因測序儀（MGISEQ-200））上 進行了研究。
首先選擇產品可檢出的 4 種代表性變異類型的 細胞系樣本進行梯度稀釋，每個濃度梯度樣本重復檢測 3 次， 將具有 100%檢出率的最低濃度設定為預估最低檢測限。之 后，將包含所有申報位點的雜合型樣本稀釋至預估最低檢測 限濃度，每個樣本重復檢測 20 次，將檢測結果為相應的基因 型別且每個型別的檢出率均≥95%時濃度，設定為最低檢測 限濃度。最后，申請人使用三批試劑盒對各個申報位點的雜 合型樣本進行重復檢測 20 次，驗證了最低檢測限。（四）陽性判斷值?
申請人使用該產品對 329 例已有地貧基因檢測結果的臨床樣本進行檢測，對非缺失型的陽性樣本進行突變頻率的統計分析，基于理論雜合突變頻率和純合突變頻率，利用 Tukey’s 檢驗確定非缺失型的陽性判斷值；對缺失型陽性樣本 和陰性樣本進行歸一化序列的統計分析，利用 k-medians 聚 類算法確定缺失型的陽性判斷值。?
申請人使用該產品對 428 例已有地貧基因檢測結果的臨 床樣本進行陽性判斷值的驗證。結果顯示陽性符合率、陰性 符合率和總符合率均為 100%，Kappa 系數均為 1。建立的陽 性判斷值能準確判斷檢測范圍內的 25 種地貧變異類型的陰、 陽性。?
為考核該產品在不同條件下性能的穩定性狀況，為試劑 盒的包裝、運輸、使用和保存條件的確定和有效期的建立提 供依據，申請人進行了穩定性研究，包括效期穩定性、凍融 穩定性等。研究結果表明：包裝盒 1 與包裝盒 2 置于-18℃以 下保存，包裝盒 3 置于 2℃～8℃保存，有效期為 12 個月；包裝盒 1、包裝盒 2 凍融 6 次仍可有效檢測；試劑盒每天開 瓶 1 次連續開瓶 7 天、每 2 天開瓶 1 次連續 2 周、每周開瓶 1 次連續 4 周、每月開瓶 1 次 4 個月內開瓶小于 4 次仍可有 效檢測。?
適用樣本穩定性研究：為考察該產品對不同條件下儲存 不同時間的樣本的檢出性能，申請人使用該產品分別對短期儲存、長期儲存的樣本進行測試，最終確定外周血樣本在室 溫下儲存 9 天、在 2℃～8℃儲存 14 天、在-18℃以下儲存 9 個月仍可有效檢測；樣本反復凍融次數應不超過 6 次；樣本 在 2℃~8℃運輸時，運輸時間不超過 8 天。?
三、臨床評價概述?
申請人在郴州市第一人民醫院、珠海市婦幼保健院、云 南省第一人民醫院共三家臨床機構完成了臨床試驗。針對已 有同類產品產品上市的基因型，采用試驗體外診斷試劑與已 上市同類產品進行比較研究；針對尚無同類產品上市的基因 型，采用試驗體外診斷試劑與 Sanger 測序法進行比較研究。?
臨床試驗的樣本類型為外周血。入組病例包括具有地貧癥狀 和/或體征的疑似地貧患者、血液學表現為小細胞低色素的疑 似地貧患者、臨床考慮為地貧攜帶者、需與地貧進行鑒別診 斷的其他疾病患者等。對于尚無同類產品上市的基因型，提 交了支持該基因型臨床意義的臨床試驗資料及相關文獻。臨床試驗共入組受試者 1108 例。有效樣本中陽性樣本 1034 例。各基因型別的陽性樣本情況如下：α-地貧缺失型 434 例，β-地貧缺失型 7 例，α-地貧非缺失型 252 例，β-地貧非缺 失型 723 例。?
臨床試驗結果顯示，該產品檢測范圍內的 25 個基因型 別的檢測結果與對比試劑/Sanger 測序法相比的陽性符合率均為 100%、陰性符合率均為 100%、總符合率均為 100%。綜上所述，該產品臨床試驗試劑符合《體外診斷試劑臨 床試驗技術指導原則》和《地中海貧血相關基因檢測試劑注 冊技術審查指導原則》的相關要求。臨床試驗結果顯示該產 品與已上市同類產品一致性較好。?
四、產品收益風險判定?
根據申請人提供的申報資料，經綜合評價，在目前認知 水平上，認為該產品的上市為適用人群帶來的受益大于風險。但為保證用械安全，基于對主要剩余風險的規避，需要在說 明書中提示以下信息：1.本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，不能作為診斷的 唯一依據。對患者的臨床診斷應結合臨床癥狀/體征、病史、 其他實驗室檢查等情況綜合考慮；2.本試劑盒適用于人的外周血樣本檢測，不適用于其它 樣本檢測；3.本試劑盒可以對 4 種缺失型 α-地中海貧血、2 種缺失 型 β-地中海貧血、3 種非缺失型 α-地中海貧血和 16 種非缺 失型 β-地中海貧血進行檢測，但仍有檢測范圍之外的變異， 可能造成漏檢，這類樣本可用其他方法進一步驗證。4.不合理的樣本采集、運送、處理、核酸過度降解以及未經 驗證的其他干擾或 PCR 抑制因子等均有可能會導致假陰性 或假陽性結果。
綜合評價意見?
本申報項目為境內第三類醫療器械產品注冊，申請人的 注冊申報資料符合現行要求，依據《醫療器械監督管理條例》 （國務院令第 739 號）、《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》 （國家市場監督管理總局令第 48 號）等相關醫療器械法規 與配套規章，經系統評價后，建議準予注冊。?
