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實時熒光PCR(real-time PCR)
實時熒光PCR(real time PCR)是目前應用最廣的核酸檢測技術，檢測模式采用閉管檢測，相對于開管檢測而言，real time PCR極大降低了擴增產物的污染機會，節省了時間和人力，便于實現自動化，更可以利用閾循環數（Cq值）支持定量檢測。
然而，real time PCR的一個很大局限在于單個反應所能檢測的靶基因數目有限。
根據目前主流熒光PCR儀器檢測通道數目，單個反應所能檢測的靶基因數目很難超過4-6個，限制了該技術在涉及多靶點的復雜疾病上的應用。
在PCR反應后添加熔解分析步驟，可在一定程度上增加可檢測靶基因數目，但是，伴隨熒光探針類型的增加，熒光背景及檢測成本也隨之升高，尤其是，探針結合區任何核酸變異都可能引起熔點偏移，導致結果誤判，使得該法對于靶標數目的提升依然受限。
與那些廣受矚目的高通量檢測技術相比，已有30年歷史的real time PCR似乎正成為一種“低階”核酸檢測技術。
“MeltArray”熒光PCR新技術
在2022年2月24日在線發表于《美國國家科學院院刊》（PNAS）的一項研究中，廈門大學生命科學學院李慶閣團隊報道了一種稱為“MeltArray”的熒光PCR新技術，一舉將熒光PCR的單管檢測能力提高到一個數量級以上，并通過多個臨床應用場景，系統展示了該技術強大而靈活的檢測能力。
"MeltArray"巧妙地利用了TaqDNA聚合酶的5'-瓣狀內切酶活性，在PCR反應中，該活性將位于引物下游的“媒介探針”切割，生成“媒介引物”，“媒介引物”進而與分子信標報告探針結合，在Taq酶聚合活性作用下，沿著分子信標延伸生成具有特定熔點的熒光雙鏈，最終使媒介探針特異識別的靶標獲得一個包括熒光類型和熔點值的“二維”標記。
由于每個分子信標可以允許多個媒介引物形成一系列具有不同熔點的熒光雙鏈，單個MeltArray多重熒光PCR反應可檢測的總靶基因數目就等于反應中分子信標數目乘以其所容納的媒介引物數目。作者在文中展示了單個熒光通道可檢測12個靶標，6個熒光通道的儀器可以檢測多達72個靶標！這是單個閉管PCR一步法迄今所能檢測的最大靶基因數目。
“多泊位”報告探針
該技術實現的關鍵是獲取一種具有“多泊位”的報告探針，以容納眾多的媒介引物。研究人員首先比較了線性探針和分子信標分別用作報告探針的優劣，分子信標因具有清晰的背景而勝出。接著，作者考察了分子信標的“多泊位”能力。他們小心翼翼地從兩重PCR開始，首先證明一個分子信標可以允許兩個“媒介引物”停泊；又通過一個四重PCR，證明了一個分子信標可以允許四個“媒介引物”疊加式停泊，由此，提出了一個分子信標可以容納任意多個媒介引物的假設。根據目前熒光PCR儀器的熔點分辨率，利用兩個分子信標，實驗驗證了單個熒光通道即可檢測12個靶基因。最后研究人員構建了一個陣列式結構的“媒介子”庫及其對應的分子信標報告探針，以實現檢測的標準化。
為降低多重PCR中多對引物并存可能產生的引物二聚體干擾，研究人員又引入了“PCR抑制”概念，至此提出了MeltArray的完整技術原理（圖1）。
“MeltArray”多重檢測能力
為驗證MeltArray的多重檢測能力，作者首先設計了一個20重PCR的MelArray檢測體系，覆蓋人類Y染色體無精子因子區域(AZFa、AZFb、AZFc和AZFd)的18個序列標簽位點和2個參照基因（SRY基因和ZFX/Y基因）。在正常男性樣本，20個位點全部存在，即均有熔解峰，而患者男性則會出現1個或多個熔解峰的缺失——該實驗是一個典型的多靶標同時出現的例子（圖2）。
實驗結果表明，該MelArray體系僅利用三個熒光通道，就實現了20個靶標的同時檢出。為評估模板量對MeltArray檢測能力的影響，作者考察了從100ng到100pg的健康男性和女性的基因組DNA，在該范圍內，所有模板均被穩定檢出。隨著DNA模板量的逐漸降低，熔解峰高度有所下降，但20個峰的熔點值均未發生變化。最后，作者通過對757份樣本的雙盲檢測，證實了MeltArray體系的準確性。
圖2? ?MeltArray技術應用于20重人類Y染色體微缺失的檢測
六熒光通道、62重PCRMeltArray檢測體系
受以上結果鼓舞，作者開始挑戰更多的靶標數目。這次，他們使用六個熒光通道設計了一個62重PCR的MeltArray檢測體系（圖3），用于識別61種O抗原合成基因及1個大腸桿菌管家基因yccT。我們看一下此時每個通道的檢測數目，按照熒光波長從低到高的次序，六個熒光通道檢測的靶標數目分別是11、9、12、12、8和10個！各個通道的重復實驗結果采用3倍標準偏差顯示，每一個靶標對應的熔點值均穩定且能明確區分。最后，作者利用該體系鑒定了167株大腸桿菌培養株的血清型，除了覆蓋范圍之外的4株，檢測結果與全基因組測序結果完全一致，而且比傳統抗血清法多鑒定出11株，還另外糾正了其鑒定錯誤的1株。
圖3? ?MeltArray技術用于61種大腸桿菌O血清型分型
MeltArray的定量檢測
上述兩個例子均為定性檢測，那么，MeltArray可否另外進行定量檢測呢？為回答這一問題，研究團隊設計了一個24重PCR的呼吸道病原體檢測體系（圖4），他們將其中的19種非定植菌/病毒和1個內控基因設置為熔解分析模式，即定性檢測；另外4種細菌設置為實時PCR檢測模式——即TaqMan探針模式，即定量檢測。
需要指出的是，作者選擇變性階段進行實時熒光檢測。他們相信，實時檢測的對象是探針酶切后積累的熒光信號，無論變性階段還是延伸階段，檢測結果應該一致。在變形階段，任何報告探針產生的熒光都會趨于一致，而不影響實時檢測結果。
事實證明了作者的這一設想。該體系在定性檢測19種靶基因的同時，成功實現了4種靶基因的定量檢測。24重PCR的MeltArray檢測體系分析靈敏度達10copies/μl。通過對67份肺炎或呼吸道感染患者的肺泡灌洗液樣本的驗證，證實了檢測結果的可靠性。
圖4? 實時PCR和熔解曲線分析同時應用于呼吸道病原體的定性和定量檢測
MeltArray的突變分析
突變分析是核酸檢測另一重要醫療器械創新網，為考察MeltArray可否用于突變分析，研究團隊以KRAS突變為例，設計了一個稱為“微測序”的突變鑒定體系，即在單個反應管內一一鑒定出發生在KRAS基因密碼子12和密碼子13上的9種類型的突變（圖5）。
在這里，作者利用了探針雜交的特異性，利用10條媒介探針，對上述9種突變類型和野生型分別加以二維標記。實驗表明，該體系具有極佳的突變檢測特異性，可耐受高達500ng的野生型基因組DNA，可檢測的突變等位基因頻率達到5%-10%，優于Sanger測序——其最低突變等位基因頻率在10%-20%之間，檢測限低至30個拷貝每反應。
最后作者利用該體系檢測了167份結直腸癌組織樣本的KRAS突變類型，獲得了與Cosmic數據庫一致的突變頻率分布，同時也表明，MeltArray比Sanger測序具有更靈敏的突變檢測能力。
圖5? MeltArray技術用于KRAS突變的微測序
MeltArray的以上四個應用場景，實際上對應了分子診斷的三大醫療器械創新網，即遺傳病、傳染病（又分別涉及到病原體鑒定及病原體定性、定量檢測這些細分領域）和腫瘤的分子診斷，顯示出MeltArray做為通用核酸檢測技術的典型特征。
當前，實現類似靶標數目的檢測均需“開管檢測”技術，如芯片、質譜、微球、電泳等，然而這些技術普遍存在設備昂貴，操作復雜、周轉時間長等缺點，且國產化率低，在國內外市場上不溫不火，長期進展緩慢。相對而言，MeltArray采用廣泛可及且已國產化的熒光PCR儀器，具有明顯的成本低、操作簡便、自動化程度高、周轉時間短等諸多優勢，結合本文所展現的強大而靈活的技術優勢，不僅成功推動熒光PCR這一“老技術”再上“新臺階”，也完美填補了長期存在于低階PCR和高通量檢測二者之間的技術空白！
廈門大學生命科學學院黃秋英助理教授、博士生陳冬梅、杜琛為共同第一作者，李慶閣教授、廖逸群副教授為共同通訊作者，共同作者包括廈門大學碩士生劉巧巧、林素、梁蘭蘭、許曄副教授。該研究得到了國家科技重大專項（No.2017ZX10302301 & No. 2017ZX10303406）、國家自然科學基金（No.81672110）、福建省社會發展高校產學合作項目（No.2019Y4002）、廈門市科技計劃項目（No.3502Z201830070 & No.3502Z20183013）的資助。本文所描述的MeltArray技術已在中國、美國、歐洲、日本、韓國獲得專利授權，并向澳大利亞等國遞交了專利申請。
李慶閣團隊長期從事熒光PCR尤其是多重熒光技術平臺研究，2001年報告一種新的寡核苷酸雜交反應模式（NucleicAcids Research），發明置換探針和置換引物（中、美、日、澳及歐洲專利授權）；2004年提出置換探針基因分型技術（NucleicAcids Research）；2006年發明探針編碼實時PCR（ClinicalChemistry，中國發明專利授權）；2011提出自淬滅探針的多色探針熔解曲線變異分析技術（Journalof Molecular Diagnostics，中、美專利授權），2013年提出基于連接反應的“熒光—熔點”二維標記技術（NucleicAcids Research,中、美、歐洲專利授權）。
