單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括堿基的顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失。它是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP作為第三代分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)、法醫(yī)物證檢驗以及疾病診斷和治療等眾多領(lǐng)域。

一、檢測方法介紹

1、測序法

Sanger測序是DNA序列分析的經(jīng)典方法，可直接獲取核酸序列信息，是SNP檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。而且，Sanger測序可發(fā)現(xiàn)未知的 SNP位點(diǎn)，確定SNP 的突變類型和突變位置，是一種無法替代的最直接、最準(zhǔn)確的SNP檢測方法。

采用測序法檢測SNP時，首先可將含有SNP位點(diǎn)的靶標(biāo)序列通過PCR擴(kuò)增形成DNA片段后，再利用Sanger測序獲取目標(biāo)區(qū)域的核酸序列，并對SNP位點(diǎn)進(jìn)行比對，由此即可確定是否存在變異位點(diǎn)。

Sanger測序是基于雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)末端終止的方法進(jìn)行檢測的。即在四個單獨(dú)的反應(yīng)體系中，分別對應(yīng)摻入四種帶有不同顏色標(biāo)記的A、T、G、C雙脫氧核苷酸，使得核苷酸在某一固定點(diǎn)開始延伸反應(yīng)，而延伸過程中若摻入ddNTP，則由于堿基上無3’-OH導(dǎo)致延伸無法繼續(xù)，從而隨機(jī)在某一特定堿基處終止，形成相差一個堿基的不同系列長度的核酸片段，再利用毛細(xì)管電泳分離這些不同長度的核酸片段，最后通過不同堿基標(biāo)記的顏色讀取待測核酸的堿基序列，由此獲得目標(biāo)區(qū)域的核苷酸序列。

? ? ? ? ? ? ? ? ??

2、TaqMan探針法

TaqMan探針是一種雙標(biāo)記、自淬滅的水解探針，其5’和3’末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，在探針結(jié)構(gòu)完整時兩者距離較近，熒光基團(tuán)的信號可被淬滅。而在PCR擴(kuò)增過程中，若TaqMan探針與靶標(biāo)序列完全匹配，探針則可結(jié)合在DNA模板上，此時Taq酶延伸至探針位置時，其外切酶活性將切割水解探針，釋放熒光基團(tuán)，使得熒光信號增強(qiáng)。而且，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增多，熒光信號越來越強(qiáng)，從而可通過儀器實(shí)時監(jiān)測熒光信號的變化過程。

針對雙等位基因SNP，可分別設(shè)計兩種對應(yīng)的探針，只有探針與模板完全匹配時，在擴(kuò)增擴(kuò)增過程中探針可被水解產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號，而如果探針與靶序列之間存在錯配，其熒光強(qiáng)度將會減弱，由此可通過熒光強(qiáng)度檢測SNP位點(diǎn)。

而由于MGB探針的長度可以設(shè)計得更短，有利于提高探針的識別特異性，因此用于檢測SNP的TaqMan探針常用MGB修飾。但在測試時，需篩選測試較多的探針，探針合成成本相對較高。

3、ARMS-PCR法

擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR)，又稱為等位基因特異性PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR)，是基于Taq DNA 聚合酶無法修復(fù)引物3’末端的單個堿基錯配，從而使得擴(kuò)增受阻的檢測方法。在擴(kuò)增過程中，只有當(dāng)引物3’末端的堿基與SNP位點(diǎn)的等位基因互補(bǔ)配對時，才能正常延伸擴(kuò)增；而當(dāng)引物3’末端的堿基與SNP位點(diǎn)的等位基因不互補(bǔ)配對時，則不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，由此對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳或熒光PCR檢測，則可確定SNP基因型。

在ARMS-PCR基礎(chǔ)上也發(fā)展出了一些改良方法，如四引物擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng) PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, Tetra-primer ARMS-PCR)。該方法設(shè)計了四條引物，其中兩條為3’末端位于SNP位點(diǎn)上的內(nèi)引物，兩條引物方向相反，且分屬于不同基因型；另外兩條為通用外引物，且兩條引物與SNP位點(diǎn)的距離應(yīng)不一樣。這樣，在反應(yīng)過程中，若四條引物均與模板完全匹配，則可擴(kuò)增出三種長度不一的產(chǎn)物(兩條內(nèi)引物位于同一位點(diǎn)上，無長片段擴(kuò)增產(chǎn)物形成)；而如果兩條內(nèi)引物中有一條引物與模板不匹配，則只形成兩種不同長度的產(chǎn)物，因此，根據(jù)電泳后產(chǎn)物大小即可判斷基因型。

然而，由于凝膠電泳檢測時間較長，而且開蓋進(jìn)行產(chǎn)物分析易造成污染，因此市面上使用ARMS-PCR方法開發(fā)的產(chǎn)品，大部分采用了閉管檢測的實(shí)時熒光PCR。ARMS-PCR法的熒光PCR檢測時，同樣使用TaqMan探針，只是將SNP位點(diǎn)設(shè)計在引物3’末端，因此理論上只有引物3’端與模板完全匹配時，才能形成擴(kuò)增曲線；但在實(shí)際檢測時，單個堿基的錯配依然可以延伸擴(kuò)增，只是效率較低。為了提高其特異性，有時需在靠近引物3’末端的位置人為引入錯配堿基，以降低非靶標(biāo)序列的擴(kuò)增效率。

4、分子信標(biāo)法

分子信標(biāo)是一段雙標(biāo)記的寡核苷酸探針，其5’末端和3’末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，且探針5’端和3’端的部分堿基可互補(bǔ)配對，從而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使得熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相互靠近而熒光信號較低。分子信標(biāo)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)部分包含SNP檢測位點(diǎn)，當(dāng)模板與分子信標(biāo)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核酸序列完全匹配時，分子信標(biāo)可與模板雜交形成伸展?fàn)顟B(tài)，從而導(dǎo)致熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的空間距離拉大，熒光信號增強(qiáng)，因此可被儀器檢測，并確定SNP位點(diǎn)。

而使用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記分子信標(biāo)，則可區(qū)分SNP類型。該方法與TaqMan探針法類似，均是通過探針中單個堿基的識別能力區(qū)分SNP。只是分子信標(biāo)采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而TaqMan探針使用MGB修飾，以提高探針對SNP的識別特異性。

?

5、高分辨率熔解曲法

高分辨熔解曲線分析技術(shù)(high-resolution melting analysis, HRM)是通過特定染料與擴(kuò)增后產(chǎn)物結(jié)合后形成特定的熔解峰進(jìn)行分析檢測的方法，其使用的特料為飽和熒光染料，具有更強(qiáng)的DNA結(jié)合能力，且不影響PCR擴(kuò)增，在DNA解鏈過程中也不會發(fā)生重排，使得熔解曲線具有更高的分辨率。

核酸片段的固有特性，如DNA序列的長度、GC含量和堿基互補(bǔ)性差異等，均能影響高分辨率熔解曲線，而結(jié)合高精度熒光定量PCR儀，其分辨精度則可達(dá)到對單個堿基差異的區(qū)分，從而可用于確定SNP位點(diǎn)。

6、CAPS法

酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS)，又稱限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)，是PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)相結(jié)合的檢測方法。該方法基于DNA片段在酶切位點(diǎn)上的堿基變異，采用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，對該DNA片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，從而產(chǎn)生不同的電泳圖譜，由此確定SNP位點(diǎn)的堿基類型。

CAPS僅能檢測位于酶切位點(diǎn)處的SNP，對于酶切位點(diǎn)以外的SNP則無法檢測。為了解決這個不足，對于那些不能采用CAPS檢測的SNP位點(diǎn)，可以使用衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(derived cleaved amplified polymorphic sequence, dCAPS)進(jìn)行檢測，即通過在引物上引入錯配堿基創(chuàng)造酶切位點(diǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)多態(tài)性檢測。

? ??

7、SNaPshot法

SNaPshot是美國應(yīng)用生物公司(ABI)開發(fā)的一種商業(yè)技術(shù)，是基于熒光標(biāo)記的單堿基延伸原理，而建立起來的分型技術(shù)，該方法也被稱為小測序。其引物設(shè)計的關(guān)鍵是延伸引物的3’末端應(yīng)緊挨著SNP位點(diǎn)，同時對不同SNP位點(diǎn)可設(shè)計不同長度的延伸引物，這樣便可通過引物長度區(qū)分SNP位點(diǎn)。

檢測時，在一個含有測序酶和四種熒光標(biāo)記的ddNTP體系中進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，由于加入的核苷酸為雙脫氧核糖核苷酸，因此引物延伸一個堿基即終止，其延伸產(chǎn)物通過測序儀檢測，根據(jù)峰移動的位置可確定延伸產(chǎn)物對應(yīng)的SNP位點(diǎn)，而根據(jù)峰的顏色則可確定SNP位點(diǎn)的堿基種類。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??

8、KASP法

KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)是基于引物末端堿基的特異性匹配對SNP進(jìn)行檢測的方法，該方法在引物和探針設(shè)計上與常規(guī)熒光PCR不同，首先需針對SNP的等位基因設(shè)計兩條對應(yīng)的上游引物，引物3’末端分別位于各自的SNP位點(diǎn)上，同時引物5’端各自帶有一段獨(dú)特的標(biāo)簽序列，而下游引物則是一條常規(guī)設(shè)計共用的引物；其次，設(shè)計兩條與上游引物標(biāo)簽序列一致的熒光探針，探針的5’端分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，同時對應(yīng)于熒光探針設(shè)計各自互補(bǔ)配對的淬滅探針，并在淬滅探針的3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。由此，在擴(kuò)增未開始時，熒光探針與淬滅探針結(jié)合，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互靠近，而無法產(chǎn)生熒光信號。當(dāng)設(shè)計的上游引物中有一條或兩條與模板完全匹配時，則可啟動擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物再結(jié)合下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，則形成含有標(biāo)簽序列的DNA片段；該帶有標(biāo)簽序列的DNA片段可與熒光探針結(jié)合，而熒光探針3’端可作為引物啟動擴(kuò)增，最后形成帶有熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，而且熒光探針對應(yīng)的淬滅探針則在擴(kuò)增過程中被切割掉，從而使得擴(kuò)增過程的熒光信號增強(qiáng)，可對SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測。

KASP法針對上游引物標(biāo)簽序列合成了兩個通用熒光探針和兩個通用淬滅探針，再結(jié)合不同SNP位點(diǎn)的特異性引物，則可對多個SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測。

9、基因芯片法

基因芯片(gene chip)是指將大量針對SNP的寡核苷酸探針高密度地固定在一固相支持物表面，從而形成多重寡核苷酸微陣列，而經(jīng)熒光染料標(biāo)記后的待測DNA片段，與芯片上固定好的探針陣列進(jìn)行雜交反應(yīng)，核酸片段只與其序列完全互補(bǔ)配對的探針雜交，不與含有單個錯配堿基的序列雜交，從而將目標(biāo)序列固定下來，再通過清洗去除非目標(biāo)片段，最后通過掃描檢測芯片上的熒光信號，由此確定SNP位點(diǎn)。

另外，也可將寡核苷酸引物的5’末端固定在固相支持物上, 而讓其3’末端作為引物進(jìn)行延伸反應(yīng)，且反應(yīng)體系中使用ddNTP作為原料，因此只能延伸1個堿基, 這個被延伸的堿基與SNP位點(diǎn)堿基互補(bǔ)結(jié)合, 由此可通過檢測芯片上的熒光信號確定SNP位點(diǎn)。

基因芯片法的檢測通量高，可實(shí)現(xiàn)自動化，市面上已有多家企業(yè)可銷售SNP芯片，如ThermoFisher、Illumina和Agilent。

10、質(zhì)譜法

質(zhì)譜法是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)的檢測方法，其檢測過程中，需通過激光激發(fā)DNA分子片段, 再利用飛行時間判斷DNA片段的分子量大小，從而確定SNP位點(diǎn)。其檢測原理同樣使用了單堿基延伸技術(shù)，在多重PCR擴(kuò)增時，其擴(kuò)增產(chǎn)物將在SNP位點(diǎn)上終止延伸，形成不同分子量的檢測產(chǎn)物，再利用質(zhì)譜分析獲得圖譜，而不同分子量的延伸產(chǎn)物，在其對應(yīng)的分子量位置上可查看檢測峰圖，由此確定SNP位點(diǎn)。

二、總結(jié)

用于檢測SNP的方法，除了測序法可直接獲取核酸信息外，其它方法均是基于已知SNP位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計的檢測方法。這些方法中，有些技術(shù)在擴(kuò)增檢測原理上類似。如TaqMan探針法和分子信標(biāo)法均是基于探針的特異性識別來區(qū)分檢測SNP位點(diǎn)的，ARMS-PCR和KASP則是基于引物特異性識別SNP位點(diǎn)的檢測方法，SNaPshot法和質(zhì)譜法則均使用了單堿基延伸技術(shù)。

SNP檢測在遺傳疾病的診斷和篩查以及用藥種類和劑量指導(dǎo)等方面有著重要的應(yīng)用價值。而2019年出現(xiàn)的新型冠狀病毒，作為一種RNA病毒，其在進(jìn)化演變過程中，也出現(xiàn)了很多SNP位點(diǎn)，其中的一些變異甚至使得新冠的傳染性和毒力存在進(jìn)一步增強(qiáng)的潛在風(fēng)險，因而時不時拉響了全球疫情警報。從Alpha、Beta、Mamma到后來的Delta，再到現(xiàn)在的Omicron，面對這些需要關(guān)注的變異株(Variants of Concern, VOC)，SNP檢測方法同樣必不可少。

參考資料

[1]YouFM, Huo N, Gu YQ, et al. BatchPrimer3: a high throughput web application forPCR and sequencing primer design. BMC Bioinformatics. 2008 May 29;9.

[2]SiyadatP, Ayatollahi H, Barati M, et al. High Resolution Melting Analysis forEvaluation of mir-612 (Rs12803915) Genetic Variant with Susceptibility toPediatric Acute Lymphoblastic Leukemia. Rep Biochem Mol Biol. 2021 Jan;9(4).