醫(yī)療器械創(chuàng)新網(wǎng)
前言
2019年12月底，在中國(guó)湖北省武漢市當(dāng)?shù)氐囊粋€(gè)海鮮和野生動(dòng)物交易市場(chǎng)：武漢華南海鮮市場(chǎng)，一種可導(dǎo)致不明原因肺炎的病毒爆發(fā)了。在2020年1月7日，中國(guó)疾控中心CCDC確證了這是一種新型冠狀病毒。2020年2月11日，世界衛(wèi)生組織將這次大規(guī)模流行疾病命名為2019-nCoV（2019-novel coronavirus disease），也稱為COVID-19.?此外，國(guó)際病毒分類委員會(huì)將2019-nCoV命名為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2）。2020年3月，COVID-19在全球爆發(fā)。新型冠狀病毒從屬于Coronaviridae?Nidovirales?中的beta型（betaCoV），是一類衣殼包裹的單鏈RNA病毒。通常BetaCoV以嚙齒類動(dòng)物作為宿主，在無(wú)中間宿主的情況下很少感染到人類。然而分別在2003年爆發(fā)的SARS，和在2016年爆發(fā)的MERS同樣從屬于BetaCoV，并對(duì)人類的公共衛(wèi)生安全造成了巨大的傷害。研究表明，新冠病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13具有98%的相似度，與蝙蝠類SARS病毒CoVZXC21具有89%的核苷酸序列相似性，與人類SARS病毒有79%的同源性。截止到目前，尚未出現(xiàn)對(duì)于新冠病毒有效的治療手段和藥物。
本次新冠病毒的爆發(fā)給我們帶來(lái)了前所未有的危機(jī)，對(duì)人類健康和生命造成巨大的威脅，給全球經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了災(zāi)難性的損失。值得慶幸的是，21世紀(jì)以來(lái)生物科學(xué)的快速發(fā)展極大的提高了全球針對(duì)重大傳染性疾病的應(yīng)對(duì)能力。在本次疫情爆發(fā)的幾天內(nèi)，新冠病毒的完整基因組數(shù)據(jù)即被公開，一個(gè)月內(nèi)，針對(duì)新冠病毒的核酸檢測(cè)試劑盒即開發(fā)完畢、投入使用。目前，全世界的科學(xué)家、醫(yī)務(wù)工作者、生物醫(yī)藥企業(yè)等已經(jīng)團(tuán)結(jié)起來(lái)，對(duì)該疾病進(jìn)行更加深入的了解，為遏制新冠病毒的轉(zhuǎn)播及開發(fā)有效的治療、預(yù)防手段貢獻(xiàn)力量。
本文將從COVID-19致病機(jī)理、檢測(cè)/診斷技術(shù)兩個(gè)方面，淺述生物技術(shù)在新冠病毒診療中的應(yīng)用。
CO-19致病機(jī)理
與其他的感染呼吸道的冠狀病毒類似，SARS-CoV-2主要是通過(guò)空氣傳播：病毒通過(guò)空氣中的小液滴或氣溶膠被吸入肺部，從而感染患者。另外，SARS-CoV-2還存在尚未被確證的糞-口傳match播途徑。新冠病毒的平均潛伏期中位數(shù)約在4～5天，之后97.5%的感染者在11.5天內(nèi)出現(xiàn)感染癥狀。其典型的早期感染癥狀與SARS十分類似，包括發(fā)熱、干咳，一些病人出現(xiàn)呼吸困難、肌肉/關(guān)節(jié)疼痛、頭暈/頭痛、腹瀉、嘔吐及咳血等癥狀。癥狀出現(xiàn)5～6天后，病毒載量達(dá)到高峰，隨著病毒對(duì)下呼吸道的感染升級(jí)，氣道的炎癥反應(yīng)加劇，導(dǎo)致肺部組織破壞，一些嚴(yán)重的患者在癥狀出現(xiàn)8～9天左右出現(xiàn)急性呼吸窘迫癥ARDS（表現(xiàn)為呼吸困難和血氧濃度降低）、細(xì)菌和真菌的繼發(fā)性感染、免疫系統(tǒng)大量分泌抗炎細(xì)胞因子形成細(xì)胞因子風(fēng)暴（CRS），以及多臟器衰竭等。最終，一些患者由于血氧過(guò)低、臟器衰竭等走向死亡（男性死亡率2.8%，女性死亡率1.7%）。
SARS-CoV-2通過(guò)其病毒衣殼上的刺突蛋白S中的RBD（receptor-binding domain）靶向呼吸道中的上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的ACE2（angiotensin-converting enzyme 2）。如圖所示，在感染過(guò)程中，SARS-CoV-2的RBD與細(xì)胞表面的ACE2結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞的內(nèi)吞作用。在該作用中細(xì)胞絲氨酸蛋白酶TMPRSS2也起到了一定的輔助。通過(guò)內(nèi)吞，病毒的RNA順利進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并進(jìn)行迅速的翻譯、表達(dá)、復(fù)制，造成細(xì)胞的裂解以及ATP、核苷酸等大量釋放。這些細(xì)胞損傷信號(hào)被周圍的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等接收，并誘導(dǎo)它們釋放出IL-6，IP-10，MIP1alpha，MIP1beta，以及MCP1等炎性因子。這些炎性因子吸引單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞至感染處，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)，形成正向反饋機(jī)制。
在免疫應(yīng)答不健全的情況下（圖左），可造成更多的免疫細(xì)胞在肺部聚集，炎癥反應(yīng)加劇，最終導(dǎo)致肺部組織的破壞。而高濃度的炎癥因子會(huì)隨血液全身循環(huán)至多處臟器，造成多臟器損傷。此外B細(xì)胞分泌的非中和抗體（通過(guò)ADE. antibody-dependent enhancement），進(jìn)一步加劇了器官損傷，最終導(dǎo)致器官衰竭。然而在正常的免疫應(yīng)答中（圖右），T細(xì)胞可在病毒擴(kuò)散之前清除感染的細(xì)胞。患者體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體可遏制病毒進(jìn)一步感染、擴(kuò)散，肺泡中的巨噬細(xì)胞可通過(guò)吞噬作用清除被中和的病毒顆粒和凋亡的細(xì)胞?？焖俚牟《厩宄杀苊獠槐匾难装Y反應(yīng)，從而將肺部損傷降到最低，促進(jìn)肺組織的痊愈。
圖1.新冠病毒感染細(xì)胞過(guò)程（圖源：Nature?Review?Immunology）??
COVID-19體外檢測(cè)技術(shù)
?對(duì)于新型冠狀病毒的檢測(cè)對(duì)于預(yù)防、防治疾病擴(kuò)散和進(jìn)展具有舉足輕重的作用。在疫情爆發(fā)的早期，由于人們對(duì)于疾病的認(rèn)知不足，很容易從一些共有的臨床表現(xiàn)上，把新冠和其他的肺炎、流感、普通感冒發(fā)燒混淆在一起。再加上新冠病毒的傳播能力強(qiáng)、速度快、致死率高，如何有效、快速、準(zhǔn)確的診斷出新冠感染患者，及時(shí)施以隔離、干預(yù)和入院治療等手段，最大程度的切斷感染源，挽救更多患者的生命成為此次疫情防治中的重中之重。
?病毒檢測(cè)一般分為直接法和間接法。直接法包括病毒特異性抗原檢測(cè)和病毒核酸檢測(cè)（DNA或RNA）；間接法即血清IgM和IgG抗體檢測(cè)。在不同的病毒感染周期內(nèi)，病毒的滴度在體內(nèi)的分布發(fā)生變化，例如，在新冠感染的初期，病毒在下呼吸道大量繁殖，因而痰液、肺泡灌洗液濃度最高，隨后病毒獲得較強(qiáng)傳播能力，因而在上呼吸道中鼻咽拭子樣本中濃度更高，在患者逐漸康復(fù)過(guò)程中，其肛拭子的含量可能高于鼻咽拭子。此外，新冠病毒所檢測(cè)的各種指標(biāo)，包括抗原、核酸、抗體等出現(xiàn)和峰值分布的時(shí)間也并不一致。比如，核酸檢測(cè)在病毒感染初期靈敏度較高；IgM抗體在感染早中期開始出現(xiàn)，滯后于核酸檢測(cè)靈敏度窗口期；IgG抗體在感染中后期才出現(xiàn)，檢測(cè)靈敏度高，但特異性較核酸、IgM檢測(cè)較低，一般用于出院的輔助判斷。目前，不管是中國(guó)新冠診療指南、美國(guó)FDA，還是WHO發(fā)布的文件，仍然將核酸檢測(cè)作為新冠病毒確診的金標(biāo)準(zhǔn)，而抗體檢測(cè)可以作為核酸檢測(cè)的重要補(bǔ)充。接下來(lái)，我們將對(duì)本次疫情中的一些主要體外檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行介紹。
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1. 核酸檢測(cè)方法學(xué)
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熒光定量RT-PCR
核酸檢測(cè)具有早期診斷、靈敏度和特異性高等特點(diǎn)，是確診新冠肺炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”。首先需要對(duì)含有病毒的樣本進(jìn)行滅活提取RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄的方式獲得病毒的cDNA，然后通過(guò)一對(duì)和病毒基因組特定片段互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，一般檢測(cè)位于病毒ORF1ab和N基因上的兩個(gè)靶標(biāo)，同一份標(biāo)本需要滿足雙靶標(biāo)陽(yáng)性或重復(fù)檢測(cè)為單靶標(biāo)陽(yáng)性或兩種標(biāo)本同時(shí)滿足單靶標(biāo)才能確認(rèn)SARS-CoV-2病毒核酸陽(yáng)性。核酸檢測(cè)樣本類型一般為鼻咽拭子、痰液、支氣管灌洗液和肺泡灌洗液。檢測(cè)程序經(jīng)過(guò)取樣、留樣、保存、核酸提取、上級(jí)檢測(cè)等一系列步驟。
此處的“熒光”表示在PCR反應(yīng)過(guò)程中引入熒光示蹤物1.加入能夠指示DNA片段擴(kuò)增過(guò)程的熒光染料（SYBR Green等）或2.熒光標(biāo)記的特異性探針（Taqman等），其熒光信號(hào)的積累與PCR產(chǎn)物的濃度有一定的換算關(guān)系。在PCR過(guò)程中，儀器不斷記錄熒光信號(hào)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。
圖2.SYBR GREEN和TAQMAN探針QPCR原理（圖源：WILEY ONLINE LIBRARY）
優(yōu)點(diǎn)：熒光定量PCR技術(shù)引入國(guó)內(nèi)已久，技術(shù)普及程度較高，各級(jí)醫(yī)院大多都具備成熟的PCR人員。在應(yīng)對(duì)疫情時(shí)，有足夠的場(chǎng)地、設(shè)備、人員進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)于復(fù)工、復(fù)學(xué)篩查，大量的第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心也具備承接大量醫(yī)療器械創(chuàng)新網(wǎng)委托的能力。從操作層面上來(lái)講，熒光定量PCR上機(jī)后2小時(shí)即可拿到結(jié)果，靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度較高，有利于實(shí)現(xiàn)本次疫情中盡早診斷、盡早隔離、盡早干預(yù)的防疫方案。另一方面，國(guó)內(nèi)在分子診斷領(lǐng)域已有諸多發(fā)展較為成熟的試劑廠家，具有成熟的研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)控、服務(wù)等經(jīng)驗(yàn)，可快速在短時(shí)間內(nèi)研發(fā)并保證大量試劑、服務(wù)的供應(yīng)。
缺點(diǎn)：熒光定量PCR檢測(cè)全過(guò)程步驟較多，操作時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)于場(chǎng)地、人員有較高的要求。由于采樣不當(dāng)（采樣位置，旋轉(zhuǎn)拭子，擦拭次數(shù)）、標(biāo)本保存不當(dāng)（2-8攝氏度保存）容易造成“假陰性”而漏診。另外，由于操作不規(guī)范，也可能引起樣本污染導(dǎo)致的“假陽(yáng)性”。
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數(shù)字PCR（ddPCR）
數(shù)字PCR可以做到對(duì)目標(biāo)核酸序列的定量和定性檢測(cè)，將具有熒光定量PCR的反應(yīng)物（Taqman探針或SYBR Green引物）加載到液滴式微流控芯片上，然后用ddPCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。在反應(yīng)完成后可通過(guò)成像分析，輸出原始數(shù)據(jù)，并經(jīng)由軟件分析得到最終結(jié)果。ddPCR以qPCR為基礎(chǔ)，但可以做到絕對(duì)定量。即，將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的qPCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中（反應(yīng)單元），每個(gè)反應(yīng)器中包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子（DNA模版），實(shí)現(xiàn)“單分子模版PCR擴(kuò)增”反應(yīng)。在反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)判別“陽(yáng)性”和“陰性”反應(yīng)器結(jié)果，利用泊松分布原理進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)讀取陽(yáng)性反應(yīng)單元的個(gè)數(shù)及比例從而得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式，主要可分為微板式、微腔式和微滴式三大類系統(tǒng)。
微滴式ddPCR在技術(shù)原理、通量和反應(yīng)單元數(shù)等方面均優(yōu)于微腔式（芯片式），更符合實(shí)際應(yīng)用需求，設(shè)備包括微滴生成儀、微滴反應(yīng)儀和微滴檢測(cè)儀三個(gè)部分，目前越來(lái)越多的廠家逐漸將其組分進(jìn)行整合，以形成ddPCR的一步操作。另外，各大ddPCR體外診斷廠家也針對(duì)樣本前處理、核酸提取、反應(yīng)體系混合等研發(fā)了全自動(dòng)的解決方案。后續(xù)在同一張芯片耗材上進(jìn)行多重標(biāo)記物擴(kuò)增或增加加樣通道等可增加ddPCR單次的檢測(cè)效率與檢測(cè)通量。
圖3.微滴式ddPCR原理（圖片來(lái)源：LabMedica）
優(yōu)點(diǎn)：ddPCR可以克服qPCR檢測(cè)不出低拷貝靶分子、細(xì)微模版濃度差異、復(fù)雜背景下稀有突變的缺點(diǎn)，可做到極高的靈敏度和精確度，其樣本制備和擴(kuò)增的時(shí)間與qPCR大體相同，但是由于其靈敏性，其樣本來(lái)源更加廣闊，并且對(duì)于病原體檢測(cè)有巨大的優(yōu)勢(shì)。
缺點(diǎn)：正由于ddPCR對(duì)于低拷貝數(shù)也能檢出，因而對(duì)于可能的樣本污染必須特別小心，環(huán)境中的一丁點(diǎn)污染都有可能在實(shí)際過(guò)程中檢出。在一體化檢測(cè)方案出現(xiàn)之前，操作步驟和檢驗(yàn)步驟較為復(fù)雜，對(duì)檢驗(yàn)師要求較高。另外，較高的背景降噪技術(shù)與熒光陽(yáng)性判讀算法對(duì)于ddPCR的精準(zhǔn)度非常重要。
??核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)
?? ???近年新發(fā)展起來(lái)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在實(shí)際操作或儀器要求方面都比PCR技術(shù)更為簡(jiǎn)單方便。新興的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、鏈替代等溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增、依賴解旋酶等溫?cái)U(kuò)增、依賴核酸序列等溫?cái)U(kuò)增、單引物等溫?cái)U(kuò)增和核酸快速等溫檢測(cè)放大等技術(shù)。
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?環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermalamplification, LAMP）
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?? LAMP是Notomi et al.于2000年提出來(lái)的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其原理主要是基于靶基因3'和5'端的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，包括1對(duì)外引物、1對(duì)環(huán)狀引物和1對(duì)內(nèi)引物，3種特異引物依靠鏈置換BstDNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成不停地自我循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增。反應(yīng)1h后可根據(jù)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀形成的濁度或者熒光染料進(jìn)行判斷擴(kuò)增情況。此反應(yīng)先形成啞鈴狀模板，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段，再進(jìn)行伸長(zhǎng)、循環(huán)擴(kuò)增，共3個(gè)階段。
圖4.LAMP原理（圖源：Research Gate）
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依賴核酸序列的擴(kuò)增?(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)
依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)?(NASBA) 是 1991 年由加拿大 Can-gene 公司首次介紹。它是一項(xiàng)以核酸序列中 RNA為模板，由兩個(gè)引物介導(dǎo)的、連續(xù)均一的特異性體外等溫?cái)U(kuò)增核苷酸序列的酶促過(guò)程。整個(gè)反應(yīng)由非循環(huán)相和循環(huán)相組成: 首先進(jìn)行非循環(huán)相，在AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，引物 I 與模板 RNA 退火后合 成 cDNA，形 成 RNA/DNA 雜 合 體，隨 即RNaseH 降解 RNA，引物Ⅱ與 cDNA 退火，合成第二條 DNA 互補(bǔ)鏈。形成的 DNA 雙鏈由 T7 RNA 聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子序列，催化合成 RNA，進(jìn)入循環(huán)相，對(duì)模板進(jìn)行大量擴(kuò)增。
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圖5.NASBA原理（圖源：//www.premierbiosoft.com/tech_notes/NASBA.html）
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滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)?(Rolling circle amplification, RCA)
1998 年建立的滾環(huán)擴(kuò)增 (RCA) 是模擬自然界微生物環(huán)狀 DNA 的滾環(huán)復(fù)制過(guò)程，發(fā)展起來(lái)的一種放大信號(hào)和靶核酸相結(jié)合的檢測(cè)方法。在具有鏈置換活性的 DNA 聚合酶作用下由一條引物與環(huán)形 DNA 模板的鏈置換合成，實(shí)現(xiàn)環(huán)狀 DNA 模板的體外等溫線性擴(kuò)增?？煞譃榫€性擴(kuò)增 (單引物 RCA)、指數(shù)擴(kuò)增、多引物擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增RCA。
圖6.多種RCA原理（圖源：Chemical Society Reviews）
圖7.RCA擴(kuò)增產(chǎn)物的多元化檢測(cè)手段（圖源：Chemical Society Reviews）
4、單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Single primer isothermal amplification，SPIA)
SPIA的核心是一條混合引物及可以切割DNA/RNA雜合鏈中RNA部分的RNA酶，由3'端DNA部分和5'端RNA部分組成。在反應(yīng)過(guò)程中，RNaseH不斷降解引物區(qū)DNA/RNA雙鏈中的RNA部分，暴露出模板上與引物RNA部分結(jié)合的位點(diǎn)，然后新引物結(jié)合上去進(jìn)行鏈置換合成，經(jīng)過(guò)RNA降解、新引物結(jié)合、鏈置換的循環(huán)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)模板互補(bǔ)序列的快速擴(kuò)增。
圖8.SPIA擴(kuò)增原理（圖源：Springer）
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依賴解旋酶?DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA)
依賴解旋酶 DNA 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (HDA) 是美國(guó)NEB 公司于 2004 年發(fā)明的一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)模擬體內(nèi) DNA 復(fù)制的自然過(guò)程，利用解旋酶在恒溫下解開 DNA 雙鏈，再由 DNA 單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定已解開的單鏈為引物提供模板，然后在 DNA 聚合酶的作用下合成互補(bǔ)的雙鏈，繼而不斷重復(fù)上述循環(huán)擴(kuò)增過(guò)程，最終實(shí)現(xiàn)靶序列的指數(shù)式增長(zhǎng)。
圖9.HDA擴(kuò)增原理（圖源：Research Gate）
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重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)
RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37攝氏度左右。
圖10.RPA擴(kuò)增及檢測(cè)原理（圖源：Research Gate）
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鏈替代擴(kuò)增?(Strand displacement amplification，SDA)
鏈替代擴(kuò)增?(SDA) 技術(shù)最早是由 Walker等人于 1992 年在 《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院匯刊》中進(jìn)行了介紹，這是一種基于酶促反應(yīng)的 DNA 體外等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，主要利用限制性內(nèi)切酶剪切 DNA 識(shí)別位點(diǎn)的能力和 DNA 聚合酶在切口處向 3'延伸并置換下游序列的能力，在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增。整個(gè)過(guò)程由準(zhǔn)備單鏈 DNA 模板、生成兩端帶酶切位點(diǎn)的目的 DNA 片段、SDA 循環(huán)擴(kuò)增 3 個(gè)步驟組成。
圖11.SDA擴(kuò)增原理（圖源：Research Gate）
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切口酶擴(kuò)增（Nicking enzyme amplification reaction, NEAR）
NEAR是2000年成立的Ionian Tech的技術(shù)，在2010年被Alere收購(gòu)，Alere在2017年被雅培收購(gòu)。反應(yīng)體系中包括三種酶：反轉(zhuǎn)錄酶、恒溫?cái)U(kuò)增酶（Bst）、切口酶（Nicking enzyme）。上下游引物在恒溫?cái)U(kuò)增酶作用下對(duì)靶序列進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增，切口酶可識(shí)別特定序列切下8-16個(gè)堿基單鏈后，形成缺口。缺口可利用恒溫?cái)U(kuò)增的DNA聚合酶繼續(xù)合成短序列。在60攝氏度下，合成的短序列自動(dòng)解旋，成為恒溫?cái)U(kuò)增酶的進(jìn)一步模版。新合成的短序列單鏈之后與帶有熒光的引物結(jié)合，從而通過(guò)熒光來(lái)定量分析。當(dāng)熒光達(dá)到一定的強(qiáng)度，認(rèn)定相應(yīng)的病毒DNA達(dá)到一定含量。
圖12.NEAR擴(kuò)增及檢測(cè)原理（圖源：ACS Publications）
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無(wú)論通過(guò)上述任何核酸等溫技術(shù)，都可以通過(guò)在擴(kuò)增產(chǎn)物上添加熒光染料、使用熒光標(biāo)記探針、通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)生的能量激發(fā)luciferase等熒光素酶等進(jìn)行顯色，通過(guò)讀取熒光或?qū)游龅姆绞絹?lái)實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)。
優(yōu)點(diǎn)：速度快（半小時(shí)內(nèi)出結(jié)果）、靈敏度高（初始只需要數(shù)百個(gè)病毒拷貝）、操作簡(jiǎn)單、對(duì)于儀器要求低（只需要1個(gè)恒溫模塊和1個(gè)熒光收集模塊）。??缺點(diǎn)：短序列的設(shè)計(jì)存在高假陽(yáng)性的可能，只能判斷陰陽(yáng)性，無(wú)法定量。目前僅有有限的廠家應(yīng)用部分核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行商業(yè)化試劑盒開發(fā)，還處在轉(zhuǎn)化的初級(jí)階段。難以適應(yīng)野外、缺少供電、環(huán)境污染高等的場(chǎng)景。
2.CRISPR方法學(xué)
CRISPR全稱是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列），而Cas的全稱是CRISPR associated（CRISPR關(guān)聯(lián)）。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種原核生物的免疫防御系統(tǒng)，用來(lái)抵抗外來(lái)遺傳物質(zhì)的入侵，比如噬菌體病毒等。同時(shí)，它為細(xì)菌提供了獲得性免疫（類似于哺乳動(dòng)物的二次免疫），當(dāng)細(xì)菌遭受病毒入侵時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的“記憶”。當(dāng)病毒二次入侵時(shí)，CRISPR系統(tǒng)可以識(shí)別出外源DNA，并將它們切斷，沉默外源基因的表達(dá)，抵抗病毒的干擾。
其主要原理為當(dāng)噬菌體病毒首次入侵細(xì)菌，病毒的雙鏈DNA被注入細(xì)胞內(nèi)部。CRISPR/Cas系統(tǒng)會(huì)從這段外源DNA中截取一段序列作為外源DNA的“身份證”，然后將其作為新的間隔序列被整合到基因組的串聯(lián)間隔排列的“重復(fù)序列”，即CRISPR序列之中。在病毒再次入侵DNA時(shí)，表達(dá)產(chǎn)生CRISPR RNA（crRNA），同時(shí)CRISPR序列附近的保守蛋白編碼基因（成為Cas基因）可表達(dá)一種核酸酶（Cas酶），這種酶和crRNA共同作用，識(shí)別入侵病毒的DNA靶序列并進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)對(duì)入侵病毒的免疫應(yīng)答。
CRISPR/Cas的強(qiáng)大之處在于，其可以對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)的精確編輯。在向?qū)NA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細(xì)胞基因組DNA（看成外源DNA）將被精確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個(gè)條件。第一，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對(duì)保守的PAM序列（NGG）。第二，向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。最基礎(chǔ)的應(yīng)用就是基因敲除。如果在基因的上下游各設(shè)計(jì)一條向?qū)NA（gRNA1，gRNA2），將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，gRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)可以靶向PAM附近的目標(biāo)序列，Cas9蛋白會(huì)使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。隨后生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制，會(huì)將斷裂上下游兩端的序列連接起來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除。如果在此基礎(chǔ)上為細(xì)胞引入一個(gè)修復(fù)的模板質(zhì)粒（供體DNA分子），這樣細(xì)胞就會(huì)按照提供的模板在修復(fù)過(guò)程中引入片段插入（Knock-in）或定點(diǎn)突變（site-specific mutagenesis）。這樣就可以實(shí)現(xiàn)基因的替換或者突變。隨著研究的深入，CRISPR/Cas技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用，除了基因敲除，基因替換等基礎(chǔ)編輯方式，它還可以被用于基因激活，疾病模型構(gòu)建，甚至是基因治療。
目前已發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)大體可分為兩類（如下圖），Class 1（包含了type I, III,?and IV），和Class 2（包含了type II和type V和type VI）。在Class1中, 對(duì)于外源基因組的剪切需要一個(gè)大的Cas蛋白復(fù)合物（由不止一種Cas蛋白組成）和引導(dǎo)RNA。在Class2中，對(duì)于外源基因的剪切只需要一個(gè)單一的剪切蛋白, 例如TypeII中的Cas9蛋白和TypeV中的cpf1蛋白。此外不同類型的CRISPR/Cas系統(tǒng)針對(duì)的靶標(biāo)類型（DNA或RNA）以及是否需要crRNA都不相同。
圖13.不同類型的CRISPR/Cas系統(tǒng)（圖源：//www.crispr.report/understanding-cas1-to-cas14-3/）
在本次新冠疫情檢測(cè)中，CRISPR/Cas技術(shù)創(chuàng)始發(fā)現(xiàn)的兩位鼻祖，MIT的張鋒團(tuán)隊(duì)（SHERLOCK Biosciences）和UC Berkeley的Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)（Mammoth Biosciences）分別使用SHERLOCK V2技術(shù)和DETECTR技術(shù)針對(duì)新冠病毒檢測(cè)開發(fā)了相應(yīng)的檢測(cè)試劑。
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1、SHERLOCK V2
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MIT的張鋒團(tuán)隊(duì)在2017年就開發(fā)出了基于CRISPR-Cas13a的檢測(cè)RNA技術(shù)，并稱為SHERLOCK(Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKingz)，該方法是通過(guò)引入人工設(shè)計(jì)的gRNA結(jié)合特異RNA序列后，Cas13a產(chǎn)生反式切割RNA。并且Cas13a在切割RNA后依然能夠保持“活躍”，繼續(xù)切割其他非目標(biāo)RNA。研究人員利用這一“脫靶缺陷”，加入一種帶有RNA的熒光標(biāo)記物，當(dāng)標(biāo)記物被切開時(shí)，會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)而顯示檢測(cè)結(jié)果。2018年公開的新技術(shù)被稱為SHERLOCK v2，與SHERLOCK相比，通過(guò)引入等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)以及Type III CRISPR中的Csm6酶，其靈敏度提高了100倍，同時(shí)由于引入了多種來(lái)自不同種屬細(xì)菌的Cas13酶，該方法能在同一樣品中檢測(cè)出多種病毒感染，例如能同時(shí)檢出寨卡和登革熱病毒。在抗擊疫情中，張鋒團(tuán)隊(duì)采用SHERLOCK V2方法開發(fā)出了配套試紙，在短時(shí)間內(nèi)顯示出檢測(cè)結(jié)果，成本只要幾美元。該方法用時(shí)約1小時(shí)（擴(kuò)增25分鐘、切斷反應(yīng)30分鐘、試紙檢測(cè)2分鐘），檢出限可達(dá)每微升10拷貝。
圖14. SHERLOCK V2對(duì)于多重病原體檢測(cè)原理（圖源：Science）
圖15. SHERLOCK檢測(cè)新冠病毒試紙條（圖源：Feng Zhang et al. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics）
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2、DETECTR??
UC Berkeley的Jennifer Doudna教授發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas12a系統(tǒng)在剪切靶向的dsDNA時(shí)其核酸酶活性會(huì)被激活，進(jìn)而可以非特異性的切割ssDNA。因此，如果反應(yīng)體系中存在針對(duì)某種病毒的靶向dsDNA，并引入非特異性熒光標(biāo)記的報(bào)告ssDNA，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)一旦檢測(cè)到目標(biāo)DNA，就會(huì)誘發(fā)核酸酶活性，從而熒光報(bào)告基因也會(huì)被降解，從而釋放出熒光信號(hào)。該技術(shù)被稱為DETECTR（DNA Endonuclease-targeted CRISPR Trans Reporter）。
圖16. DETECTR技術(shù)檢測(cè)dsDNA原理（圖源：hhmi）
圖17. SHERLOCK和DETETR技術(shù)對(duì)比（圖源：//blog.addgene.org/finding-nucleic-acids-with-sherlock-and-detectr）
優(yōu)點(diǎn)：由于CRISPR/Cas系統(tǒng)的多元性，以及和等溫核酸擴(kuò)增的結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)RNA和DNA分子的自由轉(zhuǎn)換，因而對(duì)于RNA或DNA病毒皆可開發(fā)出相應(yīng)的檢測(cè)手段、試劑。CRISPR方法速度快（1小時(shí)內(nèi)出結(jié)果）、靈敏度高（初始只需要數(shù)十個(gè)病毒拷貝）、操作簡(jiǎn)單、對(duì)于儀器要求低（只需要1個(gè)恒溫模塊，可能需要1個(gè)熒光收集模塊）、單樣本檢測(cè)成本在1美元左右。
缺點(diǎn)：仍需要擴(kuò)增，在野外、缺少供電或條件較差的環(huán)境較難使用，目前具備開發(fā)此類試劑的企業(yè)較少，技術(shù)在行業(yè)中處于轉(zhuǎn)化的初期階段。
3. 抗體方法學(xué)
??01
抗原檢測(cè)
抗原檢測(cè)指針對(duì)病原體的抗原（一般是病原體表面蛋白，有些用內(nèi)部核蛋白），采用免疫學(xué)的方法進(jìn)行檢測(cè)。抗體識(shí)別和結(jié)合抗原上的某個(gè)表位（或抗原決定簇），如果這個(gè)表位序列與其他非靶點(diǎn)蛋白的某段序列或表位相似，則可能造成抗體與非靶點(diǎn)蛋白結(jié)合，這稱為交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)是免疫反應(yīng)普遍存在的一種現(xiàn)象。
圖18.交叉反應(yīng)原理（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，侵刪）
圖19. 新冠抗原快速檢測(cè)原理（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，侵刪，嘉樂資本整理）
優(yōu)點(diǎn)：基于雙抗夾心法開發(fā)的快速診斷試劑特異性高、檢測(cè)速度快（10-15分鐘）、對(duì)儀器無(wú)依賴、操作簡(jiǎn)便、假陽(yáng)性低，因而適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。由于該方法對(duì)前期樣本制備要求低，抗原蛋白又相對(duì)穩(wěn)定，相對(duì)于核酸檢測(cè)來(lái)說(shuō)臨床穩(wěn)定性高。
缺點(diǎn)：對(duì)于較低的抗原濃度可能檢測(cè)下限要求比較難達(dá)到。
02
抗體檢測(cè)法
《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中，將患者 的血清學(xué)指標(biāo)即針對(duì)新冠病毒的特異性抗體IgM或IgG陽(yáng)性作為診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，這種方法稱為抗體檢測(cè)法，即使用抗抗體檢測(cè)患者的免疫系統(tǒng)針對(duì)新冠感染產(chǎn)生抗體的一種檢測(cè)。
靈長(zhǎng)類動(dòng)物主要有四種免疫球蛋白IgM、IgG、IgA和IgE。IgM是抗原刺激誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答中最先產(chǎn)生的Ig，可結(jié)合補(bǔ)體，誘導(dǎo)高效的殺菌、溶菌、促吞噬和凝集作用。IgG是初級(jí)免疫中最持久、重要的抗體，在抗感染中起到主力軍作用，能夠促使單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行吞噬作用，可中和細(xì)菌毒素的毒性（中和毒素），也可與病毒抗原結(jié)合使病毒失去感染宿主細(xì)胞的能力（中和病毒）。IgA分為血清型和分泌型兩種，血清型IgA可介導(dǎo)調(diào)理吞噬ADCC作用，分泌型IgA是機(jī)體粘膜防御系統(tǒng)的主要成分。IgE主要與過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)。在人體對(duì)抗新冠病毒感染的過(guò)程中，IgM和IgG是“主力軍”。?抗體檢測(cè)法的原理利用了人體對(duì)病原體感染產(chǎn)生的天然反應(yīng)。在病毒感染人體初期，人通常在7-10天內(nèi)在血清中出現(xiàn)對(duì)該免疫原的特異性IgM抗體。如果血清中檢出病原體特異性IgM，則提示新發(fā)感染，機(jī)體內(nèi)抗感染的“先頭部隊(duì)”已經(jīng)激活。在感染發(fā)生20天左右，可以檢測(cè)到針對(duì)病原體的特異IgG抗體，表明患者處于感染中后期。如IgM/IgG雙陽(yáng)，表明患者的免疫系統(tǒng)正與病毒進(jìn)行搏斗。
圖20.人體在病原刺激后的體液免疫反應(yīng)曲線（圖源：//www.vazymebiotech.com/products_detail/productId=267.html）
圖21.新冠病毒IgM/IgG快速檢測(cè)試劑盒使用流程
圖22.新冠病毒IgM/IgG快速檢測(cè)試劑盒結(jié)果判讀
除了膠體金、免疫層析等可開發(fā)快速檢測(cè)試劑的方法，新冠病毒IgM/IgG也可以使用酶聯(lián)免疫、化學(xué)發(fā)光、流式熒光等方法學(xué)進(jìn)行檢測(cè)。這些技術(shù)平臺(tái)需要儀器輔助（流水線或者POCT），有的平臺(tái)還伴有全自動(dòng)樣本處理、上級(jí)檢測(cè)一體化解決方案，適用于大批量樣本篩查，其檢測(cè)速度也可以和快速檢測(cè)相媲美。
圖23.常用的免疫診斷方法介紹（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，侵刪）
優(yōu)點(diǎn)：在抗體檢測(cè)方法學(xué)中，較抗原檢測(cè)更容易研發(fā)和實(shí)現(xiàn)，靈敏度高，體內(nèi)對(duì)病原發(fā)生免疫反應(yīng)后即可檢測(cè)。便于開發(fā)快速檢測(cè)試劑盒，方便與現(xiàn)在IVD中較為成熟的技術(shù)平臺(tái)、POCT平臺(tái)進(jìn)行結(jié)合。廠家具有開發(fā)此類產(chǎn)品較豐富的經(jīng)驗(yàn)，可以在疫情出現(xiàn)時(shí)，快速跟進(jìn)研發(fā)、生產(chǎn)和銷售、使用，第一時(shí)間推向市場(chǎng)。
缺點(diǎn)：樣本中的干擾物質(zhì)如類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、補(bǔ)體、因使用鼠抗治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig抗體等，樣本溶血、樣本被細(xì)菌污染、貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、凝固不全等造成的檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陽(yáng)性。由于捕獲抗體（抗IgM/IgG）會(huì)結(jié)合血清中的任意IgM或IgG，該方法的特異性僅基于一對(duì)新冠抗原-抗體的特異性識(shí)別（因?yàn)椴东@的新冠特異IgM/IgG會(huì)結(jié)合新冠病毒抗原），因而在復(fù)雜樣本中，會(huì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合而引起的假陽(yáng)性。另外由于待檢人員血清中的IgM或IgG處于不同階段，可能會(huì)出現(xiàn)漏檢的問題。
圖24.新冠病毒實(shí)驗(yàn)室診斷方法比較（抗原檢測(cè)vs.抗體檢測(cè)）(圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，侵刪)
結(jié)語(yǔ)
?此次的新冠疫情對(duì)全世界的公共衛(wèi)生體系應(yīng)對(duì)能力以及相關(guān)的生物醫(yī)藥技術(shù)提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。然而，此次我國(guó)對(duì)于疫情的響應(yīng)速度還是很快的，在疫情出現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)的極短時(shí)間內(nèi)，新冠病毒的基因組信息即向全世界進(jìn)行了公布。國(guó)內(nèi)的IVD企業(yè)也在疫情出現(xiàn)的1個(gè)月內(nèi)研發(fā)出了相關(guān)的檢測(cè)試劑盒，并不斷進(jìn)行優(yōu)化。目前我國(guó)研制的新冠檢測(cè)試劑盒已經(jīng)遠(yuǎn)銷海外，助力全球各國(guó)的抗疫行動(dòng)。
在全球范圍內(nèi)，各種診斷技術(shù)平臺(tái)、方法百花齊放，與不同的國(guó)家地區(qū)、應(yīng)用場(chǎng)景相結(jié)合或不同的檢測(cè)方法之間相結(jié)合，有望在病毒感染人體的各個(gè)階段，進(jìn)行損傷最小、依從性最高、速度最快、成本較低的精準(zhǔn)判斷。同時(shí)，在針對(duì)新冠病毒疫苗治療手段研發(fā)如火如荼的進(jìn)程中，新冠病毒體外診斷技術(shù)也將為評(píng)估療效、判斷預(yù)后貢獻(xiàn)一份巨大的力量。針對(duì)新冠疫情得以應(yīng)用的新型體外診斷技術(shù)平臺(tái)也可擴(kuò)展適用于其他感染病原體、腫瘤輔助診斷、精準(zhǔn)用藥等項(xiàng)目，致力于我國(guó)IVD產(chǎn)業(yè)技術(shù)水平、服務(wù)質(zhì)量的整體提升。
