患者樣品檢測(cè)結(jié)果與真值間的偏離主要有三個(gè)因素，包括系統(tǒng)偏差、隨機(jī)偏差和干擾。分析干擾是指在測(cè)定某分析物的濃度或活性時(shí)，受另一種非分析物影響而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果增高或降低。

在某種程度上由一個(gè)干擾物引起的未預(yù)料作用可使臨床檢驗(yàn)結(jié)果具有顯著誤差。

生產(chǎn)企業(yè)和實(shí)驗(yàn)室有必要在醫(yī)學(xué)需要的基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)干擾物，告知臨床已知有醫(yī)學(xué)意義的誤差來(lái)源。

一、概? ? 念

分析特異性：一種分析方法檢測(cè)某種成分的能力或者只對(duì)一種指定的分析反應(yīng)物而不是樣品中其他物質(zhì)。

在《中國(guó)醫(yī)藥報(bào)》中分析特異性被定義為：測(cè)量程序只測(cè)量被測(cè)量物的能力。

干擾：由于另一成分的影響或樣品的特性，待測(cè)的一定濃度的被分析物出現(xiàn)有臨床意義的偏倚。

內(nèi)源性干擾：樣品中一些生理物質(zhì)（膽紅素，血紅蛋白）對(duì)某些物質(zhì)分析時(shí)引起的干擾。

外源性干擾：源自體外的物質(zhì)（如藥物、樣品防腐劑或樣品污染物）對(duì)某些物質(zhì)分析時(shí)引起的干擾。

干擾物/干擾物質(zhì)：樣品中不同于分析物且能引起測(cè)試結(jié)果偏倚的組分。

基質(zhì)：樣品中除分析物之外的其他成分。

基質(zhì)效應(yīng)：基質(zhì)對(duì)分析物測(cè)定結(jié)果的影響。如粘性，表面張力，pH值等。

交叉反應(yīng)：在結(jié)構(gòu)上和抗原相似的干擾物在免疫學(xué)方法中與抗體發(fā)生的反應(yīng)。

二、干擾機(jī)制

• 物理效應(yīng)：干擾物與被分析物相似，比如熒光，顏色，光散射，洗脫位置或者是可以被探測(cè)或被測(cè)量的電極反應(yīng)。

  
  

• 化學(xué)效應(yīng)：干擾物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)物而抑制反應(yīng)，或者抑制指示劑反應(yīng)，也可以通過(guò)配位絡(luò)合或沉淀反應(yīng)而改變被分析物的形式。

  
  

• 酶的抑制：干擾物通過(guò)隔離金屬激活劑，結(jié)合到催化部位或氧化關(guān)鍵巰基而改變酶的活性。

  
  

• 基質(zhì)效應(yīng)：干擾物改變樣品基質(zhì)的物理特性，比如粘度、表面張力，濁度或離子強(qiáng)度，引起分析物的測(cè)量結(jié)果明顯改變。

  
  

• 交叉反應(yīng)：在結(jié)構(gòu)上與待測(cè)物抗原相似，干擾物在反應(yīng)時(shí)與抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致測(cè)量不準(zhǔn)確。

  
  

• 水被取代：非水融性物質(zhì)（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)）通過(guò)取代血漿水的容量而影響以活性測(cè)定為基礎(chǔ)的測(cè)量方法。

  
  

• 非特異性：干擾物以和被分析物相同的方式發(fā)生反應(yīng)。

三、分析特異性試驗(yàn)的方案

在EP7文件中推薦了兩種分析特異性評(píng)價(jià)方案，“干擾篩選方案”和“患者樣品偏倚分析方案”。但每一種方案都有其優(yōu)點(diǎn)和內(nèi)在局限性，生產(chǎn)廠家或?qū)嶒?yàn)室最好能綜合應(yīng)用兩種方案，方可較全面評(píng)估產(chǎn)品分析特異性能。

擾篩選方案：此方法具體分為兩步

• 第一步先進(jìn)行配對(duì)差異試驗(yàn)，即將潛在的干擾物添加到樣品中評(píng)價(jià)干擾效應(yīng)，然后評(píng)價(jià)相對(duì)于未添加干擾物的對(duì)照樣品的偏倚。

  
  

  根據(jù)分析物情況進(jìn)行幾個(gè)醫(yī)學(xué)決定水平濃度處的試驗(yàn)，最通常的方法是在高濃度下，對(duì)一系列可能的干擾物做初步篩選；

  
  

• 第二步劑量效應(yīng)試驗(yàn)，用含有干擾物高濃度水平和濃度水平的兩個(gè)樣品，通過(guò)精確定量吸樣，制成一些列不同濃度的測(cè)試樣品。可以確定干擾物濃度和干擾度之間的關(guān)系的試驗(yàn)方法。

干擾篩選方案由于是人為加入干擾物，存在以下局限性

• 添加到樣品中的化合物的特性可能不同于在體內(nèi)自然循環(huán)狀態(tài)下的化合物；

  
  

• 試驗(yàn)樣品基質(zhì)不代表典型的有問(wèn)題的臨床樣品；

  
  

• 樣品中真實(shí)的干擾物可能不是原來(lái)的藥物，而是代謝產(chǎn)物；

  
  

• 實(shí)驗(yàn)濃度太高或太低以致不真實(shí)。

患者樣品偏倚分析:

選擇特定患者樣品，如心臟，腎臟或肝臟疾病患者樣品，含有高血脂，高膽紅素或高血紅蛋白的樣品，用過(guò)某種可能有干擾藥物的患者樣品。用參考方法（或比較方法）和試驗(yàn)方法同時(shí)測(cè)定，將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，以確定試驗(yàn)方法是否存在干擾。

此方案需要參考方法或者具有低干擾性和高特異性的比較方法，已確定在比較研究中的“真值”。

該方案試驗(yàn)變異缺乏控制對(duì)照，存在以下局限性:

• 此方案只能證明偏倚和估計(jì)的干擾物質(zhì)某水平的相關(guān)性，而不能證明其因果關(guān)系；

  
  

• 患者通常服用多種藥物，可能導(dǎo)致內(nèi)源性代謝物濃度的增高，難以證實(shí)何種藥物的干擾作用;

  
  

• 干擾物可能不存在于該批患者的測(cè)試樣品中;

  
  

• 樣品不新鮮，一些不穩(wěn)定的組分可能丟失。

小編綜合考慮我國(guó)國(guó)內(nèi)十余篇檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則和《WS/T416-2013 干擾實(shí)驗(yàn)指南》，其中的法規(guī)并沒(méi)有強(qiáng)制要求進(jìn)行“患者樣品偏倚分析方案”評(píng)估，而且考慮其樣本獲取較難，實(shí)驗(yàn)的可行性較低；

下面著重介紹“干擾篩選方案”的具體操作步驟，不再對(duì)“患者樣品偏倚分析方案”做過(guò)多介紹。

四、干擾篩選方案步驟

?配對(duì)差異試驗(yàn)

圖1:配對(duì)差異試驗(yàn)步驟

1、基礎(chǔ)樣品：從健康沒(méi)有進(jìn)行藥物治療的個(gè)體獲得適當(dāng)類型（血清，全血，尿液）的新鮮樣品。

注意如果難以獲得新鮮樣品，可用合適的凍干或冷凍的樣品代替，但需要注意的是冷凍樣品中是否含有防腐劑，穩(wěn)定劑或促凝劑等，這些物質(zhì)也會(huì)導(dǎo)致干擾效應(yīng)。

確定批內(nèi)差：選擇含一定濃度分析物且不含干擾物的樣品，最好選擇兩個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)10次，計(jì)算其均值和批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差。

2、根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)，確定差別的標(biāo)準(zhǔn)dma；

3、根據(jù)公式計(jì)算含干擾物樣品所需的重復(fù)測(cè)量次數(shù)n=

其中在z1-a\2是正太分布時(shí)雙側(cè)檢驗(yàn)100（1-α）%的百分位值；? Z1-β\2是正太分布時(shí)100（1-β）%的百分位值；S：批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差；dmax是分析物在某測(cè)試濃度水平時(shí)的最大允許干擾值；

比如，生產(chǎn)廠家要檢測(cè)可接受干擾程度為1.5mg/ml的干擾效應(yīng)，95%的置信限（α=0.05）和95%的檢驗(yàn)效能（β=0.05），批內(nèi)精密度為1.0mg/ml，則代入公式

N=2[(1.96+1.645)×1.0/1.5]2=11.6≈12，即每一個(gè)測(cè)試和對(duì)照樣品重復(fù)次數(shù)應(yīng)為12次。

4、根據(jù)步驟③確定的重復(fù)檢測(cè)數(shù)，準(zhǔn)備試驗(yàn)組樣品。

先將合適且純度較高的干擾物進(jìn)行溶解或稀釋，可供選擇的溶劑有：試劑等級(jí)的水，稀 釋的HCl或NaOH，乙醇或甲醇，丙酮，二甲基亞砜（DSMO）等。

向步驟①中所述的基礎(chǔ)樣品中加入上述干擾物溶液作為對(duì)照組樣品，盡可能小地稀釋樣品基質(zhì)，最好小于5%。

5、根據(jù)步驟③確定的重復(fù)檢測(cè)數(shù)，準(zhǔn)備對(duì)照組樣品。

向步驟①所述的基礎(chǔ)樣品中加入干擾物的溶劑作為對(duì)照組樣品，其添加體積與試驗(yàn)組相同。

6、按交互順序測(cè)試對(duì)照組和試驗(yàn)組樣品進(jìn)行測(cè)試；

7、數(shù)據(jù)分析：計(jì)算dobs和dc，其中dobs=

其中dnull為無(wú)效假設(shè)規(guī)定的值，通常為0；n為重復(fù)測(cè)試次數(shù)，s為批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差；

8、結(jié)果解釋：當(dāng)dobs≤dc時(shí)，則認(rèn)為該物質(zhì)引起偏倚小于 dmax，不是干擾物質(zhì)；若dobs＞dc時(shí)，則認(rèn)為該物質(zhì)引起干擾，應(yīng)進(jìn)行劑量效應(yīng)試驗(yàn)，進(jìn)一步確定其干擾效應(yīng)。

劑量效應(yīng)試驗(yàn)方案

劑量效應(yīng)試驗(yàn)是確定干擾物濃度和干擾度之間的關(guān)系，干擾度是測(cè)試范圍之內(nèi)任何干擾物濃度的效應(yīng)估計(jì)。

如果配對(duì)差異試驗(yàn)方案中的分析物出現(xiàn)干擾效應(yīng)，則應(yīng)通過(guò)劑量效應(yīng)試驗(yàn)，以確定干擾物在不同濃度時(shí)的干擾度，干擾物的系列濃度應(yīng)通過(guò)高值樣品和對(duì)照樣品混合制備。

1. 準(zhǔn)備高濃度干擾物樣品和基礎(chǔ)樣品；

   高濃度干擾物樣品：向基礎(chǔ)樣品中加入稀釋好的干擾物，制備成一定濃度干擾物的樣品。

2. 制備0%，25%，50%，75%，100%高濃度待測(cè)樣品；

3.在同一分析批次內(nèi)測(cè)定上述5個(gè)樣品，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)3次;

4.計(jì)算低濃度樣品平均值，其他各組結(jié)果減去該最低濃度樣品的平均值，進(jìn)行回歸分析;

5.結(jié)果解釋：根據(jù)步驟④所進(jìn)行的回歸分析，可得到干擾物在不同濃度的干擾度，干擾物無(wú)論是呈現(xiàn)線性干擾還是非線性干擾，根據(jù)回歸曲線，都可以計(jì)算出干擾物在一定濃度時(shí)對(duì)分析物檢測(cè)結(jié)果的干擾程度。從而可以排除干擾物的影響，準(zhǔn)確得到分析物的量。

五、干擾試驗(yàn)報(bào)告

主要包括以下內(nèi)容：

• 被評(píng)價(jià)檢測(cè)系統(tǒng)的名稱、品牌、型號(hào)、所用試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的生產(chǎn)廠家及批號(hào)。

  
  

• 被測(cè)量的名稱

  
  

• 被評(píng)價(jià)干擾物化學(xué)名稱或通用名稱

  
  

• 干擾評(píng)價(jià)方案依據(jù)

  
  

• 干擾試驗(yàn)中使用的樣品類型及被測(cè)量濃度與干擾物濃度；

  
  

• 表述干擾效果的相關(guān)數(shù)據(jù)或方程；

  
  

• 描述干擾效果時(shí)，可用以下方式：列出干擾物的特定濃度，低于此濃度未觀察到具臨床意義的干擾；列出干擾物的特定濃度，高于此濃度可引起超過(guò)干擾標(biāo)準(zhǔn)的偏差；

  
  

六、總? 結(jié)

本文依據(jù)EP7以及《WS/T416-2013 干擾實(shí)驗(yàn)指南》，對(duì)如何評(píng)估產(chǎn)品的分析特異性的方法進(jìn)行了介紹。

根據(jù)小編對(duì)我國(guó)國(guó)內(nèi)大部分檢測(cè)試劑盒注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則理解，審評(píng)中心一般將分析特異性分為兩部分，一部分為交叉反應(yīng)，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的抗原，抗體及嗜異性抗體等的驗(yàn)證。

另一部分為干擾物質(zhì)，樣品中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，如高脂，黃疸，類風(fēng)濕因子，抗凝劑等干擾因子的研究。如在《2019新型冠狀病毒抗原抗體檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審評(píng)要點(diǎn)》中，明確要求交叉反應(yīng)要對(duì)HKU1，OC43，H1N1，等進(jìn)行驗(yàn)證，要求干擾物質(zhì)中對(duì)膽紅素，血脂，血紅蛋白，類風(fēng)濕因子等進(jìn)行驗(yàn)證。

但值得說(shuō)明的是，由于不同廠家所用檢測(cè)抗體不同，方法學(xué)不同，其對(duì)應(yīng)的交叉反應(yīng)的物質(zhì)和干擾物也不盡相同。

目前沒(méi)有一種方法可以有效的鑒別所有的干擾物，一些干擾物，如藥物代謝產(chǎn)物在篩選實(shí)驗(yàn)中不能被鑒別出，而一些物質(zhì)又可能被錯(cuò)誤的劃分為干擾物，如非天然后添加的物質(zhì)。路漫漫其修遠(yuǎn)兮，吾將上下而求索。

因此，生產(chǎn)廠家和實(shí)驗(yàn)室的研發(fā)人員都應(yīng)盡可能弄清實(shí)驗(yàn)方法的特異性以及干擾物質(zhì)給患者樣品帶來(lái)的影響，除根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)確定干擾物外，還應(yīng)開(kāi)展試驗(yàn)驗(yàn)證，評(píng)價(jià)其醫(yī)學(xué)意義并設(shè)計(jì)改進(jìn)方案等。