引言：感染性疾病診斷市場在IVD行業一直是最大的細分市場，感染性疾病的診斷技術也一直在不停發展，從最早的培養法，到血液學分析、特定蛋白檢測、免疫學抗原抗體檢測，再到病原體質譜和核酸分析，手段越來越精準，讓人眼花繚亂。如何從眾多技術中洞察未來發展趨勢，找準最大的風口，請跟隨我一起，來一場感染性疾病診斷技術的旅行吧！
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人類發展進程中，感染性疾病一直是嚴重威脅人類健康的重大疾病，歷史上傳染病大爆發有過多次記載：霍亂、歐洲鼠疫（黑死病）、西班牙大流感等等，大瘟疫流行期間，最多殺死過1/3人口（歐洲中世紀大瘟疫死亡2500萬人）。
今年年初由新型冠狀病毒引發的瘟疫，截止目前（2020.3.3）感染人數超8萬人，死亡超3000人，也會被載入人類史冊。
以往傳染病的大爆發，因為沒有及時的隔離措施（主要靠事后將尸體焚燒）、有效的傳染病病原體鑒定技術以及良好醫學治療手段的支撐，傳染人數和死亡數都非常可怕，現代社會管理體系，在以上三方面都有了長足的進步，從武漢1.23封城到疫情控制，基本只用了1個月，新發病例急劇減少，這一個月內，診斷產品快速研制、藥物快速篩選和試錯，都為瘟疫控制起到了極大的作用。
筆者近十年一直從事體外診斷IVD行業，現嘗試對感染性疾病的診斷技術進行一次概括，以期讓大家對感染性疾病診斷有一次全面的了解，因為能力有限，一家之言，肯定偏跛，有興趣的朋友歡迎探討。?感染性疾病目前診斷技術手段主要有：培養、免疫學檢測、核酸檢測、質譜法。
1、培養
培養技術主要是將人體的血液以及其他體液（尿液、胸腹水、痰液、腦脊液、膿液等等）接種到特制培養基或活體上進行微生物培養，一直是感染性疾病診斷的“金標準”，但這個“金標準”因為培養周期長效率低、培養陽性率或成功率有限、容易引入雜菌或定植菌等因素，逐漸受到其他診斷技術的挑戰，后面會對其他三種臨床上常用的診斷技術進行分別敘述。
培養技術的發展方向，基本就是朝著自動化發展，自動化培養/接種/劃線、自動化鑒定與藥敏試驗、自動化染色，減少人工操作負擔和誤差。
這里再補充一點，做微生物顯微鏡檢，目前很多醫院還在經常使用，直接肉眼觀測來判斷。
?2、免疫學檢測?
免疫學檢測，主要是利用高特異性的抗原抗體反應以及高靈敏度的分子信標來檢測樣本中的待測物。感染性疾病中，病原體侵襲人體，突破機體非特異性的第一道防線和第二道防線后，最終被具有特異性的第三道防線——免疫系統所識別。病原體自身的蛋白、核酸或磷脂等物質會刺激人體免疫系統產生特異性抗體，同時病原體自身物質也會微量殘留在機體內，通過檢測病人血樣或其他樣本中的病原體抗體或抗原，來判斷病原體的存在。
近50年來，免疫診斷技術有了長足的發展，開發出了以上圖示常見免疫學診斷技術。
目前主流技術是化學發光免疫分析，因其自動化程度高、檢測結果準確、靈敏度高而受到臨床及檢驗領域的廣泛使用和認可，也是目前IVD行業最熱門、競爭最激烈、市場份額占比最大、利潤最高的細分市場。
如此眾多的免疫學檢測技術，區別主要在于檢測結果的準確度和靈敏度。
新興的單分子免疫分析技術，檢測靈敏度可以達到fg/ml（1fg=10-15g）左右，也在逐漸走入大家的視野。通常來說，一個靈敏度更高的技術出現，往往會推動科研學術界發現新的biomarker（生物標志物），疾病診斷的參考依據也會更加多樣化和精準，整個IVD市場蛋糕也會被做大。
除了準確度靈敏度，免疫檢測還有重要突破點，那就是多重檢測。
常規免疫檢測，都是單指標檢測，也就一個測試只能檢測一個指標。這種效率非常低，設備檢測通量基本受制于機械機構設計。流式熒光法和數碼液相芯片的出現能大大提高檢測通量：
1. 流式熒光法，典型代表是美國Luminex，2000年就嶄露頭角了，作為平臺型技術，可以開發免疫和分子相關的檢測指標。在免疫方面，通過編碼微球技術，Luminex可以最多同時檢測100個指標，120樣本/h的處理速度，可以達到12000測試/h的檢測通量。
2. 數碼液相芯片技術，典型代表是美國Applied Biocode，將半導體光刻技術應用到IVD領域，通過光刻法將12位二進制數字條碼刻到磁珠上（上圖所示），這種工藝可以制備出4096種（212=4096）不同編碼的數碼磁珠，每種編碼也就意味著一種指標，而且可以同時檢測免疫和分子指標。?免疫學診斷技術在感染性疾病的使用已經很普遍了，因為操作相對簡便，日常檢測比核酸手段更加常見，例如常說的術前八項（HBV HCV HIV TP），還有其他呼吸道感染病原體（流感 肺支 肺衣 合胞 腺病毒等），通過檢測抗體或抗體即可進行初步診斷。?實驗室診斷技術包括免疫診斷的發展方向，主要在兩個：
1. 自動化：所有手工或半自動設備，將往自動化方向發展，例如分子診斷，然后實現流水線作業，并最終實現全實驗室自動化（total laboratory automation，TLA）和無人化。該方向業內有些專家提出了質疑，TLA會不會反而降低部分指標TAT；還有人提出“水果籃理論”，會不會因為利益關系，而降低了實驗室整體的質量。
2. 便捷小型化：例如血氣或微型化學發光或分子POCT，實現POCT全場景即時檢測，脫離中心實驗。首要是便捷，其次才是體積，POCT核心并不是小，而是便捷，這是常見的誤區。?
這兩個方向存在的問題：
1. 自動化方向，人口增長及老年化帶來的樣本量急劇增高，醫院大樓不可能一直擴建，實驗室空間也很難繼續擴大，在實驗室設備人滿為患的當下，加之很多產品（例如生化儀器、化學發光分析儀）的單通道檢測通量已經達到極限，如何滿足未來檢測量的需求，怎么進一步提高實驗室的通量，已經成為擺在檢驗界同行面前的一個現實問題。
2. 小型化方向，設備小型化最常用的開發思路就是將大型設備的功能或參數下調，例如減少樣本位和試劑位、降低溫控系統的體積、減少運動部件使用，甚至在操作自動化、性能指標上降低要求，看似達到了小型化目的，但也帶來了客戶操作體驗或產品性能的下滑，這是絕對不可取的，而且不要忽視了POCT產品本身也有通量需求。出現以上問題，原因在于機械結構設計的局限性，而要解決這個問題，必須要重新思考技術實現形式，幸運的是，新的技術實現形式涌現出來，其中以微流控技術為主要代表。
鑒于以上思考，筆者認為，這種兩極分化的發展方向，在本質上是一致的：在保證性能的前提下，提高實驗室單位空間（或者單位占地面積）的通量。
同時，筆者提出2個關鍵指標：博德致遠系數B（比通量）=T/V，博德致遠系數B2（坪效）=T/S，T為通量throughput，V為空間volume，S為占地面積square，這是業內首次提出該概念。
??3、質譜技術
質譜（Mass Spectrometry，MS）技術是一種譜學分析方法，它是通過制備、分離、檢測氣相離子來推測、鑒定和定量分析化合物的一門技術，核心原理是不同質量的離子具有不同的質荷比（m/z），在磁場和電場中，離子發生速度色散和質量分離。所謂譜學分析，除了質譜，還有光譜、色譜和波譜。
質譜技術，可以根據離子源和質量分析器來進行組合分類。
離子源主要有：電子電離EI、化學電離源（Chemical Ionization，CI）、快原子轟擊（FAB）、電噴霧（ESI）和基質輔助激光解吸（MALDI）等，后面兩個促進了質譜在生物大分子分析領域的應用，2002年J.B.Penn和田中耕一因ESI質譜和MALDI質譜獲諾貝爾化學獎。
質量分析器主要有：四極桿Quad、離子阱ionTrap、飛行時間TOF、雙聚焦、傅立葉變換。
另外，質譜技術常需要搭配色譜技術，本質上是一種層析技術，利用不同樣品與固定相和流動相之間的相對移動力差別，在兩相中進行多次平衡，從而達到對樣品的相互分離。
常用色譜主要有：（1）氣相色譜GC（2）液相色譜LC或高效液相色譜HPLC（3）毛細管電泳CE（4）超臨界流體色譜SFC等等。根據色譜和質量分析器也能對質譜技術進行組合分類，例如：LC-MS、GC-MS等。
質譜在臨床上的應用，主要有：新生兒遺傳代謝疾病篩查、藥物濃度檢測、維生素檢測、激素類檢測、腫瘤標志物篩選、微生物鑒定和核酸分析等。其中基質輔助激光解吸飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of -flight massspectrometry，MALDI-TOF MS）目前越來越多用于微生物鑒定和核酸分析工作。該技術對樣品純度要求不高，可以直接使用臨床樣本，或者經過分離培養挑選單菌落進行檢測，獲得其蛋白質譜圖，與更新的微生物數據庫參考圖譜進行比對，從而鑒定至屬、種、乃至亞種的水平，縮短了鑒定的時間。對臨床常見的隱球菌鑒定，MALDI-TOF MS也表現了極好的鑒定能力。
臨床質譜的發展方向，筆者個人認為：（1）進一步降低質譜設備成本（2）提高自動化程度和降低實驗室條件要求（3）提高檢測通量（4）方法學需要標準化（5）加強微生物數據庫建設
?4、核酸檢測?
核酸檢測，包括核酸分子雜交、核酸擴增技術、基因芯片、測序技術等技術。利用核酸檢測感染性疾病中的病原體微生物已經在臨床、疾控、環境等領域廣泛使用，任何生物（朊病毒除外，這是一個奇葩特例）都含有特異的核酸，通過核酸分析技術，可以直接得出樣品中微生物的存在。
其中核酸分子雜交包括膜上印記扎染、熒光原位雜交、芯片雜交、RNA酶保護分析法、核酸酶S1保護分析。
核酸擴增技術，按照擴增反應溫度是否變化，分為PCR變溫擴增技術和恒溫擴增技術。其中，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）技術根據定性或定量能力分為：普通PCR定性技術、熒光qPCR定量技術和數字dPCR絕對定量技術。
PCR技術的發明絕對是人類生物學研究的一大里程碑事件，直接促成了分子生物學的迅猛發展，僅次于沃森和克里克對DNA雙螺旋的發現，DNA雙螺旋發現是直接開創了分子生物學。
這樣一個godkiller技術的發明過程也是頗具傳奇色彩：1983年嗑藥后飆車的老司機Kary Mullis大神在幻覺下爆發出來的靈感，最終通過實驗嘗試并證明可行性。PCR專利一經公布，并火遍全球，對人類分子生物學的研究起到了極大推動作用。（這個PCR專利建議每一個從事生物研究的人都學習下）。關于PCR技術的進一步發展，筆者還想提下另一位大神，美國猶他大學的Carl Wittwer教授，后面會介紹他的貢獻。
PCR屬于底層原理技術，專利壁壘極高，根本無法繞開。同時，PCR技術需要經過變性、退火和延伸三個步驟，三個步驟均在不同溫度下進行（見上圖，后來經過酶改造，退火和延伸的溫度可以統一），溫度控制要求也就比較高。基于以上原因（主要還是專利原因），就有學者們發明了與PCR這種變溫核酸擴增技術相對應的恒溫擴增技術（Isothermal amplificationtechnology，IAT）。
恒溫擴增技術也有各種流派，常見的有：LAMP環介導等溫擴增、RPA重組酶聚合酶擴增（有公司也叫RAA技術）、RCA滾環擴增、SDA酶促DNA體外等溫擴增方法、CRP交叉引物恒溫擴增技術、TMA轉錄介導核酸擴增、NASBA基于核酸序列擴增、SAT實時熒光恒溫擴增檢測等等。
另外，還需要提及一種技術，branch DNA信號放大技術（見上圖）。PCR和IAT技術都是將核酸進行擴增，通過染料或探針的信號增強來提高核酸檢測靈敏度，而branchDNA技術不將核酸進行擴增，而是直接通過將單靶標分子的信號直接放大，無需抽提純化RNA，無需反轉錄，無需PCR擴增，只要將樣本用特定裂解液裂解后，經探針雜交與信號放大后即可迅速得到基因定量結果。
基因芯片是利用基因微陣列技術，將特異的寡核苷酸片段以高密度排列在片基上，與目的片段進行識別和雜交，通過特定的檢測系統和分析系統進行結果解讀，可實現多靶標多種病原體微生物的同時檢測。
測序技術根據先進程度分為一代測序（sanger測序）、二代測序（即NGS，illumina和Thermo為主的高通量大規模平行測序）、三代測序（PacBio公司的SMRT、Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測序技術），在讀長上，三代測序可以達到幾十kb，遠超二代測序技術，未來潛力巨大。
NGS用于感染性疾病是最近幾年興起的，因為測序會測出樣本中所有的微生物，而不是像PCR那樣單一靶標，所以被稱為mNGS（meta-genomicsNGS）宏基因組學分析，這項技術最大的優勢是解決PCR檢測靶標相對單一的問題，可以檢出未知病原體。
在此，讓我們來回顧下mNGS技術在本次新冠疫情中的使用。
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基因編輯技術是近些年異常火爆的生物技術，尤其是經過南方科大賀建奎胚胎編輯事件后，為社會大眾廣泛認知。
基因編輯技術主要由兩位大神發現：麻省理工學院-哈佛大學Broad研究所張鋒研究員、加州大學伯克利分校Jennifer Doudna教授。
這兩位大神后來分別成立了Sherlock Biosciences和Mammoth Biosciences公司，利用基因編輯技術，通過gRNA靶向和Cas酶的定向剪切，實現核酸靶向檢測，可在試紙條上顯色直接肉眼觀測，在第三世界國家傳染病防控和治療上有一定價值。
具體實驗操作，以張鋒團隊新冠病毒檢測試劑盒為例：
大致步驟就是：RNA提取純化、RPA擴增、Cas13酶切、顯色判別。未來有可能做到免提取，只需要一個恒溫水浴鍋即可，這樣才能真正滿足第三世界的條件要求。?
5、四種技術在感染性疾病診斷中的使用比較
筆者先為大家鼓個掌，你們能堅持看到這里，一定程度說明了你們對技術的熱愛和好奇。同時，大家心里可能也一直有個疑問，這些技術之間有什么差別，我應該怎么選擇呢？
從多方面綜合考慮，核酸檢測是最優方案，培養是最普及方案，免疫學和質譜可作為輔助手段聯合使用。
?6、不同核酸分析技術的比較
核酸檢測（即分子診斷）在感染性疾病的診斷中，經過分析是最優方案，一旦解決了核酸檢測現狀，就會全面普及，市場開始爆發。但是核酸檢測的不同技術也有差別，請看下表。
筆者認為，每種技術均有優勢與局限性，所以使用場景的選擇和市場定位就顯得尤為重要。
常規操作PCR是最優選項，IAT因為性能問題可以作為備選方案，可用于寵物醫療和食品環境檢測；基因芯片有一定價值，但開發難度、成本和性能上還需要提高；mNGS使用場景相對受限，屬于ICU危重癥病人采用PCR有限病原體排查后仍然無法確診的最后方案。
?7、核酸分析未來的發展方向
?筆者認為，PCR作為最成熟的分子診斷技術，還有很廣闊的開發空間，伴隨精準診斷的意識覺醒，分子診斷市場將迎來爆發增長。
上圖是筆者關于診斷技術與產品的發展方向的判斷，一家之言，現對各方面逐一講解。
1. 全自動和全集成：現有市場上的PCR儀器，本質上是一個精密溫控和光學檢測設備，而PCR儀器檢測的核酸樣品，還需要經過上游的樣本裂解處理和核酸提取純化過程。傳統PCR實驗操作，分別在四個獨立實驗室內部操作，以防止樣本間的核酸污染，見下圖。
全集成是指四步操作能在一臺設備內全部完成，而全自動是指能在一臺設備內完全自動完成，中間無需人工操作或干預。
IVD其他領域全自動都已經實現，例如血球、凝血、生化、免疫等，唯獨分子診斷因為技術門檻還未完全實現和普及。市面上已經出現了兩種全自動解決方案：全自動核酸一體化分析工作站、全自動微流控核酸分析系統。
全自動核酸工作站，不同于其他IVD全自動設備，核酸分析因為過于靈敏，對樣本交叉污染和氣溶膠污染是零容忍的，所以除了高難度的機械結構設計，還對氣流控制和模塊封閉性有很高的要求，這進一步加大了研發門檻。另外工作站的采購成本也很高，也限制了醫院的使用。當然這種產品在疾病爆發階段（例如本次新冠疫情）能發揮更大的作用。
另一種解決方案——全自動微流控核酸分析系統——則能更好的滿足當下的醫院檢測需求，利用先進的微納制造技術，將PCR實驗每一步操作集成在微流控裝置內（產品形式有：芯片、卡盒、離心盤），實現全自動一體化核酸分析。?2. 全封閉：如果能做到全自動和全集成操作，核酸如果能全流程在一個封閉體系內，無需開蓋，樣本不會與空氣有任何接觸，這樣才會真正解決樣本間的核酸污染和氣溶膠問題。這方面目前只有微流控技術能實現，微流控技術將試劑各組分內置在芯片或卡盒內部，操作時，僅需將樣本加入到微流控芯片或卡盒預設的加樣孔，然后封閉加樣孔、上機檢測即可。?3. 快速：PCR需要通過控制溫度來實現核酸變性、退火和延伸步驟，三個步驟為一個循環（cycle），結束后核酸數量放大一倍（即擴增一倍），通常PCR反應需要30~40個cycle。目前常規PCR擴增耗時一般需要1~2小時，快的能達到30min，這只是擴增檢測步驟，還不包括前面的樣本處理和提取。
PCR擴增速度與溫控模塊的升降溫速度和精度有很大關系，而升降溫速度和精度與PCR反應體系的體積也成負相關，PCR反應體積越小，升降溫能更快，精度更高。
目前全球PCR研究結果顯示，PCR能實現最快0.4s/cycle，20s內完成整個PCR反應，這個成果由世界知名PCR專家美國University of Utah大學Carl.Wittwer教授發明。Carl Wittwer教授同時是羅氏LightCycle、Biofire Filmarray、快速PCR、極限PCR、熔解分析、HRM分析的發明人，他對PCR技術的發展可以說僅次于PCR技術發明人Kary Mullis，是筆者最為欽佩的人之一。
微流控技術因為反應體系小，從而可以實現更快的擴增速度。
?4. 多重和超多重：多重檢測是指一個反應體系內能同時擴增檢測的靶標數量。對于感染性疾病，因為我們并不知道病人感染了哪種病原體，如果采用傳統單靶標PCR試劑盒，每次只能檢測一種靶標，若檢測為陰性，則需要更換檢測其他靶標的PCR試劑盒，這樣效率就大大降低，異常盲目，俗稱“大海撈針”。要做到更快確診、鑒別診斷和排除診斷，就要設計多重檢測技術。
據統計，90%感染性疾病基本由50種左右病原體微生物導致，所以檢測50個靶標能解決臨床診斷的大部分問題，省下的10%就交給mNGS，這也是從衛生經濟學上來考慮的。?5. 高通量：除了以上要求，檢測設備在樣本檢測通量上也應該有一定要求，來滿足醫院日益增加的核酸檢測需求。
