關(guān)于發(fā)布《2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審評要點(diǎn)》的通告（2020年第4號）

2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審評要點(diǎn)

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一、適用范圍

2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑用于對咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物等樣本中的2019新型冠狀病毒核酸進(jìn)行體外定性檢測。本審評要點(diǎn)適用于進(jìn)行首次注冊申報的產(chǎn)品。

二、性能評估：

企業(yè)應(yīng)提交在符合質(zhì)量管理體系的生產(chǎn)環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。1.核酸（RNA）提取/純化性能在進(jìn)行靶核酸檢測前，應(yīng)有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有RNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸提取試劑/方法的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗(yàn)證，提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。2.最低檢測限（1）最低檢測限的確定將含有2019新型冠狀病毒的真實(shí)臨床樣本/含有該病毒RNA片段的假病毒顆粒梯度稀釋于（與適用樣本一致的）適當(dāng)基質(zhì)中，用于進(jìn)行最低檢測限研究，應(yīng)采用科學(xué)的方法標(biāo)定病毒滴度。每個濃度梯度最少重復(fù)三次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢測限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣品，每個濃度至少重復(fù)20次檢測，將具有90%～95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測限。在進(jìn)行最低檢測限的確定時，應(yīng)至少包括不同來源的三個具有代表性的2019新型冠狀病毒樣本，進(jìn)行系列梯度稀釋。（2）最低檢測限的驗(yàn)證選擇不同來源的至少3個病毒樣本（與最低檢測限確定不同的病毒樣本）在最低檢測限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)達(dá)到90%～95%陽性檢出率。應(yīng)提供詳細(xì)的病毒液滴度的確定方法及驗(yàn)證結(jié)果。3.不同區(qū)域病毒樣本包容性的驗(yàn)證至少驗(yàn)證包括具有時間和區(qū)域特征性的10個不同來源的病毒樣本（陽性臨床樣本或分離培養(yǎng)物），應(yīng)包括最低檢出限、重復(fù)性等性能的驗(yàn)證，病毒樣本的滴度應(yīng)采用科學(xué)合理的方法進(jìn)行標(biāo)定。4.分析特異性（1）交叉反應(yīng)驗(yàn)證包括：①地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒；H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C組，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸道病毒A、B、C、D組，人間質(zhì)肺病毒、人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、輪狀病毒、諾如病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒；肺炎支原體、肺炎衣原體；軍團(tuán)菌、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、結(jié)核分枝桿菌；?煙曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌等。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的濃度水平為10⁶cfu/ml或更高，病毒為10⁵pfu/ml或更高，提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。②人類基因組DNA。（2）內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評價，在病毒臨界陽性水平進(jìn)行干擾試驗(yàn)驗(yàn)證。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)（如血液、鼻腔分泌物、粘液及用于緩解淤血、鼻噪、刺激或哮喘和過敏癥狀的鼻腔和咽喉藥物、抗菌藥物、抗病毒藥物等）及在樣本采集和制備期間引入的物質(zhì)。表1 推薦用于干擾試驗(yàn)的物質(zhì)

三、注冊檢驗(yàn)

應(yīng)提供符合產(chǎn)品技術(shù)要求的、在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行的產(chǎn)品檢驗(yàn)報告，應(yīng)提供連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的檢驗(yàn)合格報告。該項(xiàng)目已有國家參考品，應(yīng)使用國家參考品進(jìn)行注冊檢驗(yàn)。

四、陽性判斷值確定資料

陽性判斷值確定資料主要指對申報產(chǎn)品病毒核酸檢測的Ct值，即結(jié)果判斷的臨界值進(jìn)行確認(rèn)的資料。陽性判斷值研究資料樣本來源應(yīng)考慮不同年齡、性別、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。應(yīng)說明所選擇陽性判斷值研究方法的合理性，閾值設(shè)置應(yīng)科學(xué)合理。提供內(nèi)標(biāo)值的確定方法和研究資料。

五、主要原材料研究資料

此產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗(yàn)資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗(yàn)資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。1.引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對應(yīng)情況。建議每種病毒設(shè)計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和試驗(yàn)等方式，對病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價，選擇最佳組合，并提交篩選的研究數(shù)據(jù)。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性實(shí)驗(yàn)等。2.脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗(yàn)證資料。3.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、功能性等進(jìn)行評價和驗(yàn)證。4.試劑盒內(nèi)質(zhì)控品試劑盒的質(zhì)控體系通過設(shè)置各種試劑盒質(zhì)控品來實(shí)現(xiàn)，其應(yīng)參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程。以對整個提取和PCR擴(kuò)增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。申報資料應(yīng)對試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗(yàn)資料詳細(xì)說明。企業(yè)應(yīng)對質(zhì)控品的檢測結(jié)果（如Ct值）做出明確的范圍要求。4.1陰性質(zhì)控品應(yīng)不含試劑盒所檢測的靶序列。4.2陽性質(zhì)控品陽性質(zhì)控品可用1～2個病毒株為代表，應(yīng)含有天然的或人工合成的包含試劑盒可檢測靶序列（如假病毒）。?5.內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）可以對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增，申請人應(yīng)對內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針設(shè)計和模板濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。對內(nèi)對照的檢測結(jié)果（如Ct值）亦應(yīng)做出明確的范圍要求。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)），對待側(cè)樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。6.企業(yè)參考品應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際需要自行設(shè)定企業(yè)內(nèi)部參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、重復(fù)性參考品。陽性參考品應(yīng)著重考慮不同來源的病毒樣本和滴度要求，應(yīng)至少選取不同來源的5個病毒樣本。陰性參考品則主要涉及對交叉反應(yīng)的驗(yàn)證情況，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠狀病毒（可采用假病毒）、MERS冠狀病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。檢測限參考品的濃度水平可采用90～95%陽性檢出水平或略高于最低檢測限的水平，如100%陽性檢出水平。檢測限參考品的濃度確定應(yīng)科學(xué)合理。重復(fù)性參考品建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應(yīng)為最低檢出限附近的濃度。申請人應(yīng)對內(nèi)部參考品的來源、型別鑒定、病毒滴度等信息進(jìn)行精確的試驗(yàn)驗(yàn)證，并提交詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

六、主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用圖表方式表示，并說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。2.反應(yīng)原理介紹。3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設(shè)置，提供相關(guān)的研究資料。（1）研究樣本采集時間點(diǎn)的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。（2）研究對采樣拭子及樣本保存液的要求：對采樣拭子的材質(zhì)要求（包括對拭子頭和拭子桿的要求），保存容器要求，裂解液、保存液成分、濃度、使用量的要求等。4.確定最佳反應(yīng)體系的研究資料，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取純度的情況下盡量擴(kuò)大總反應(yīng)體系和加樣量。5.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。6.如申報產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對核酸分離/純化過程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。

附表：